202922. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új limfotoxin-polipeptidek előállítására
1 HU 202 922 B 2 Q-n (Fa. Pharmacia). Az így kapott limfotoxin-oldat ELISA- meghatározás szerint 0,01-0,05% közötti maradék E. coli proteint tartalmaz. Az N-terminális szekvenálás azt mutatja, hogy a következő limfotoxin-származékok keverékéről van szó: 1. Met-limfotoxin Met-Leu-Pro-Gly-Val-Gly-Leu- Thr-Pro-Ser 2. delta 3-limfotoxin Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Ser-Ala- Ala-Gln-Thr 3. delta 23-limfotoxin His-Ser-Thr-Leu-Lys-Pro-Ala- Ala-His-Leu 8. A delta 23-limfotoxin összehasonlító anyag tisztítása és jellemzése. Megfelelő rázatott tenyészetből (lásd 2. és 6. példa) származó 20 g centrifugált E. coli sejttömeget 200 ml 8,5 pH-jú 20 mmólos nátrium-foszfát pufferban szuszpendálunk, és 15 perces ultrahangkezelés után 4 ml 2 mólos mangán(D)-klorid oldattal elegyítve lecsapjuk a nukleinsavakat. Centrifulálás után a felülúszót híg ammónium-hidroxid oldattal 8,9 pH-ra lúgosítjuk, és 78 g ammónium-szulfáttal lecsapjuk a nyersproteint. A csapadékot centrifugálás után elkülönítjük, 100 ml 9,0 pH-jú 10 mmólos nátrium-foszfát pufferban oldjuk, és a pufferral szemben dializáljuk. Q-Sepharose-on és SSepharose-on (Fa. Pharmacia) végzett kromatográfiával homogén proteinoldatot kapunk, amely (SDS-gélelektroforézissel végzett analízis szerint) 99% feletti tisztaságú N-terminálisan metionint tartalmazó delta 23- limfotoxint tartalmaz. A protein N-terminális szekvenciája: Met- His-Ser-Thr-Leu-Lys-Pro-Ala-Ala-His- Leu-Ile. 9 9. A delta 24-limfotoxin tisztítása és jellemzése. 110 g megfelelő delta 24-limfotoxint termelő E. coli rázatott tenyészetből (lásd 3. és 6. példa) centrifugálás után nyert nedves biomasszát 1 liter pufferban (20 mmól nátrium-foszfát, 400 mmól arginin.HCl, pH 8,5) szuszpendálunk, és 4 °C-on végzett ultrahangkezeléssel feltárjuk. A kapott szuszpenzióhoz a nukleinsavak lecsapására 20 ml 2 mólos mangán(II)-oldatot adunk. Az oldható proteinffakciót 1,5 óra múlva centrifugálással nyerjük. Az oldat pH-ját híg ammónium-hidroxid oldattal 8,9-re állítjuk. A delta 24-limfotoxint 4 °C-on keverés közben hozzáadott 390 g ammóniumszulfáttal (60%-os telítés) csapjuk ki. Az ammóniumszulfátos csapadékot 300 ml pufferban (20 mmól nátrium-foszfát, 0,1 mmól arginin.HCl, pH 10,5) oldjuk, és éjszakán keresztül dializáljuk 20 liter ugyanezen pufferral szemben. A dializált proteinoldatot anioncserélő-oszlopon (Q- Sepharose-ff, Fa. Pharmacia) kromatografáljuk. A proteint finomtisztítás céljából egymás után CM-Sepharose-on (Fa. Pharmacia) és S-Sepharose-on kromatografáljuk. A protein tisztasága SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis szerint 99%-nál nagyobb. A protein N-terminális metionintől mentes. Az N- terminális szekvencia: Ser-Thr-Leu-Lys-Pro- Ala-Ala-His-Leu-Ile. 10. A delta 25-limfotoxin tisztítása és jellemzése. Delta 25-limfotoxint termelő E.coli rázatott tenyészetből (lásd 4. és 6. példa) származó 176 g nedves biomasszát centrifugálás után 600 ml pufferral (20 mmól nátrium-foszfát, 400 mmól arginin, pH 8,5) szuszpendálunk. A sejtfeltárás 4 ’C-on ultrahangos kezeléssel történik. A nukleinsavak lecsapására a szuszpenziót 2 mólos mangán(II)-klorid oldattal 40 mmólos végkoncentrációra állítjuk be. Egyidejűleg az oldat pH-ját 12,5%-os ammónium- hidroxid oldattal 7,5-re állítjuk. Centrifugálás után a felülúszóhoz literenként 390 g ammónium-szulfátot adva 4 ’C-on kicsapjuk a delta 25-limfotoxint. A csapadékot 300 ml 10,5 pH-jú 20 mmólos nátrium-foszfát-pufferban oldjuk. A nem oldódó protein aggregátumok eltávolítása céljából a zavaros oldatot centrifugáljuk. A felülúszót 5 mmólos 8,5 pH-jú nátrium-foszfát pufferral szemben dializáljuk, és végül egy Q-Sepharose oszlopon (Fa.Pharmacia) kromatografáljuk. A delta 25-limfotoxint tartalmazó frakciót finomtisztítás céljából egymás után CMSepharose-on (Fa.Pharmacia) és Q-Sepharose-on (Fa.Pharmacia) kromatografáljuk. Az így kapott protein tisztasága SDS- poliakrilamidgél-elektroforézis szerint 99%-nál nagyobb. A protein a fermentációs körülményektől függően egyáltalán nem vagy csak kevés N-terminális metionint tartalmaz. Az N-terminális szekvencia a meghatározás szerint a következő: Thr-Leu-Lys-Pro-Ala-Ala-His-Leu-Ile-Gly-11. Humán rekombináns limfotoxin (LT) és a delta 23-, delta 24-, delta 25-limfotoxin (LT)-mutánsok in vitro citotoxikus aktivitása a TNF- és limfotoxin-szenzitív L929 sejtvonalak és WEHI-164 ellen. 5*103 frissen tripszinizált, exponenciális növekedési stádiumban lévő sejtet 96-lyukas lemezeken 125 pl komplett növesztő táptalajon (MEM Earle sókkal + 10% brojú magzatszérum, Flow Laboratories, Meckenheim, FRC) szélesztünk, és éjszakán keresztül 37 ’C-on 5% szén-dioxidot tartalmazó, vízgőzzel telített atmoszférában inkubáljuk. A tápanyaghozzáadás a következő napon történik tenyészetlyukanként 25 jxl komplett tenyésztáptalajban. A startkoncentráció 10 ng protein milliliterenként; kettős sorozattitrálás egy kettősmeghatározással. Midenegyes tenyészetlappon a következő kontrollokat mellékeljük: a) csak táptalaj; b) sejtek táptalajjal, de limfotoxin nélkül; c) ismert biológiai aktivitású titrált TNF-standard. Az előbb megadott körülmények között végzett további 48 órás inkubálás után a túlélő sejteket kristály ibolya-oldattal (15 g kristályibolya, 7 g nátrium-klorid, 646 ml etanol, 172,8 ml 37%-os formaldehid oldat, vízzel 2 literre feltöltve) megfestjük. Ehhez a táptalaj lecsapása után a sejteket 20 percig 50 pl festékoldattal festjük szobahőmérsékleten. Utána a tenyészetlapokat addig mossuk vízzel, amíg a sejthez nem kötődő összes színezéket el nem távolítjuk. A sejt által megkötött színezéket 100 pl mérőoldat (50%-os etanol, 0,1% ecetsav) hozzáadása után 540 nm-nél egy Thertek Multiscan MCC/340 (Flow Laboratories, Meckenheim) segítségével fotometriásan határozzuk meg. Megadjuk azokat a limfotoxin- illetve 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
