202922. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új limfotoxin-polipeptidek előállítására
1 HU 202 922 B 2 BamHI felismerési helyére való inszerciójával keletkezik. A pLyt 15 plazmidot ismert módon a Bbvl/Accl valamint az Accl/Sall restrikciós endonukleázokkal az előállító (Boehringer Mannheim, NSZK) adatai szerint nyitjuk fel (3. és 4. ábra). Az emésztési 5 elegyet .5%-os poliakrilamidgélen elektroforézissel ismert módon (Maniatis et al., loc. cit. 173-178 old.) szétválasztjuk, és a töredéket etidium-bromiddal végzett festéssel tesszük láthatóvá. A két szükséges Bbvl/Accl és Accl/Sall limfotoxin-génfragmenst ez- 10 után kivágjuk az akrilamid-gélből, és a mátrixtól elektroforetikusan elválasztjuk. A két fragmens 0,1 pmól mennyiségeit utána 0,1 pmól pUC18 EcoRl/Sall vektorral és a KS 23/24 szintetikus oligonukleotiddal éjszakán keresztül 15 'C-on ligáljuk. 15 KS23: 5’ AATTCATGCATAGC 3’ KS24: 3’ GTACGTATCGTGGG 5’ így a 4. ábra szerinti pKS301 hibridplazmidot kap- 20 juk. 3. Olyan hibridplazmid előállítása, amely tartalmazza a 25-171 aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid (delta 24 limfotoxin) részére a génfrag- 25 menst. Kiindulási pont a pLyt 15 plazmid. Ez a Sau 3A-val hasított limfotoxin cDNS-nek (lásd 3. ábra) a pUC18 BamHI felismerési helyére való inszertálásával keletkezik. A pLyt 15 plazmidot ismert módon a 30 Bbvl/Accl valamint Accl/Sall restrikciós endonukleázokkal nyitjuk fel a gyártó adatai szerint (3. és 5. ábra). Az emésztési elegyet 5%-os poliakrilamidgélen ismert módon elektroforézissel választjuk szét. A töredékeket etidium- bromiddal végzett festéssel látha- 35 tóvá tesszük. A két szükséges Bbvl/Accl és Accl/Sall limfotoxin-génfragmenst utána kivágjuk az akrilamidgélből, és elektroforetikusan elválasztjuk a mátrixtól. Mindkét fragmens 0,1 pmólnyi mennyiségét azután 0,1 pmól pUC18 EcoRl/Sall vektorral és a KS 27/28 40 szintetikus oligonukleotiddal éjszakán keresztül 15 °C- on ligáljuk. KS27: 5’ AATTCATGAGC 3’ KS28: 3’ GTACTCGTGGG 5’ 45 így az 5. ábra szerinti pKS302 hibridplazmidot kapjuk. 4. Olyan hibridplazmidok előállítása, amelyek tártál- 50 mázzák a 26-171 aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid (delta 25 limfotoxin) részére a génfragmenseket. A hibridplazmid felépítése a 2. és 3. példában leírtak szerint történik az új KS29/30 oligonukleotidokkal. 55 KS29: 5’ AATTCATG 3’ KS30: 3’ GTACTGGG 5’ így a 2. és 3. példához hasonlóan az új KS303 hibridplazmidot (lásd 6. ábra) kapjuk. 60 5. A hibridplazmidok transzformációja. Megfelelő E. coli, például W3110 (ATCC 27325) sejteket 0,1-0,1 pg pKS301, pKS302 és pKS303 hibridplazmiddal transzformálunk, és ampicilünt tartalmazó agarlemezeket szélesztünk. Utána a kiónokat, amelyek helyesen integrált limfotoxin-részszekvenciákat tartalmaznak, plazmid- gyorsanalízissel azonosítjuk (Maniatis et al., loc. cit. 366. és 367. old.). 6. A limfotoxin-aktivitással rendelkező polipeptidek kifejezése. A 2., 3. és 4. példákban kapott hibridplazmidokat önmagában ismert módon [Gene 27, 151 és 161 (1984); 15, 81 (1981)] egyetlen EcoRl hasítási helyükön szintetikusan előállított szignálszekvenciákkal (Pharmacia-LKB, Freiburg, NSZK) látjuk el a kifejezéshez. Ezeket az új expressziós plazmidokat E. coliba transzformáljuk. A termelősejtek tenyésztése normál teljes táptalajon [10 g/lit. pepton, 5 g/lit. élesztőkivonat, 10 g/lit. nátrium-klorid és 100 mg/lit. ampicillin] történik. A limfotoxin és a limfotoxmutánsok termelésére a következő táptalajt használjuk: Élesztőkivonat, Difco NZ Amin A, Sheffield Dikálium-hidrogén-foszfát Kálium-dihidrogén-foszfát Ammónium-klorid Kalcium-klorid-dihidrát Mangán(II)-klorid-tetrahidrát Kálium-szulfát Magnézium-szulfát-heptahidrát Etilén-diamin-tetraecetsav Vas(III)-klorid-hexahidrát Cink(II)-oxid Réz(II)-klorid-dihidrát Kobalt(II)-nitrát-hexahidrát Ammónium-molibdát-tetrahidrát +100 mg/lit. ampicillin pH-beállítás 7,0-re. 20 g/lit. 20 g/lit. 4 g/lit. 1 g/lit. 1 g/lit. 0,01 g/lit. 0,2 g/lit. 2,6 g/lit. 0,5 g/lit. 0,05 g/lit. 0,005 g/lit. 0,0005 g/lit. 0,0001 g/lit. 0,0001 g/lit. 0,0001 g/lit. 7. A limfotoxin összehasonlító anyag tisztítása és jellemzése. 136 g limfotoxin-termelő E.coli törzs (lásd 164 965 sz. európai szabadalmi leírást) nedves masszát, amelyet megfelelő limfotoxin- kifejező rázatott tenyészet centrifugálásával nyerünk, 800 ml 8,5 pH-jú 20 mmólos nátrium-foszfátpuffer, 400 mmólos arginin-HCl oldatban szuszpendálunk. A sejtszuszpenziót ultrahangos kezeléssel 4 °C-on feltárjuk. A nukleinsavak lecsapása 20 ml 2 mólos mangán(II)-klorid oldattal történik a pH 12,5%-os ammónium- hidroxid oldattal 7,2-re való beállítása közben. Centrifugálás és a csapadék elválasztása után a felülúszóhoz keverés közben 4 °C- on 390 g ammónium-szulfátot adunk. A proteincsapadékot centrifugálás és a felülúszó eldobása után 200 ml 20 mmólos 8,5 pH-jú nátrium-foszfát pufferral oldjuk, amely 0,1 mmól arginin.HCl- t tartalmaz. A pufferoldatot dializáljuk, utána egymás után ioncserés kromatografáljuk Q-Sepharose-on, S-Sepharose-on és Mono 4
