202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 (2) cDNS szintézise A cDNS-t az alábbiak szerint szintetizáljuk. 4 mikrogramm TNF mRNS-ben feldúsult frakciót 100 mikroliter, 10 mmól/1 magnézium-kloridot, 70 mmól/1 kálium-kloridot, 1 mmól/1 ditiotreitolt, 0,5 mmól/1 dTTP- t, 0,5 mmól/1 dATP-t, 0,5 mmól/1 dGTP-t, 0,5 mmól/1. 32P-ral jelzett dCTP-t (specifikus aktivitása 4,4*10° beütés/nmól), 3 mikrogramm oligo(dT)i2-i8-at és 80 egység madár mieloblaztozis vírusból származó reverz transzkriptázt tartalmazó, 50 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 8,3) oldunk, és 43 °C-on 90 percen át inkubáljuk. A reakciót ezután EDTA hozzáadásával leállítjuk. A kapott cDNS-mRNS hibridet 1:1 arányú fenol- kloroform eleggyel extraháljuk, és etanolból kicsapva a vizes fázisból visszanyerjük. A mRNS templátot 65-70 °C-on végzett lúgos kezeléssel eltávolítjuk. A szintetizált sscDNS-t etanolos kicsapással visszanyerjük. Az sscDNS csapadékot 40 mikroliter, 0,5 mmól/1 dATP-t, 0,5 mmól/1 dTTP-t, 0,5 mmól/1 dCTP-t, 0,5 mmól/1 dGTP-t, 5 mmól/1 magnézium- kloridot, 70 mmól/1 kálium-kloridot, 1,5 mmól/1 2-merkapto- etanolt és 8 egység E. coli DNS-polimeráz I-et (nagy fragmens) tartalmazó, 0,1 mól/1 koncentrációjú Hepespufferben (pH 6,9) oldjuk, és 15 °C-on 20 órán át inkubálva szintetizáljuk a dscDNS-t. A reakciót nátriumdodecil-szulfát hozzáadásával leállítjuk. A dscDNS-t fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, és etanolból kicsapva visszanyerjük. A kapott dscDNS-t 100 mikroliter, 1 mmól/1 cinkszulfátot, 200 mmól/1 nátrium-kloridot, 0,5% glicerint és 0,5 egység SÍ nukleázt tartalmazó, 50 mmól/1 koncentrációjú nátrium-acetát-pufferben (pH 4,5) oldjuk, és 37 °C-on 20 percen át inkubálva elhasítjuk a hajtű-szerkezetet. A reakciót EDTA hozzáadásával leállítjuk. A reakcióelegyet fenol-kloroform eleggyel, majd dietil-éterrel extraháljuk. A dscDNS-t etanolból kicsapva nyerjük vissza. (3) Oligo(dC)-végű cDNS előállítása A fenti (2) pontban kapott dscDNS-t 100 mikroliter, 1 mmól/1 kobalt-kloridot, 0,1 mmól/1 ditiotreitolt, 0,2 mikrogramm poli(A)-t, 0,1 mmól/1 3H-dCTP-t (specifikus aktivitása 5400 beütés/pmól) és 10 egység terminális dezoxinukleotidil- transzferázt tartalmazó, 130 mmól/1 nátrium-kakodilát-30 mmól/1 Tris-HCl pufferben (pH 6,8) oldjuk, és 37 ”C-on 20 perces inkubálással a dscDNS 3’-végéhez hozzákapcsoljuk az oligo(dC)- végcsoportot. A reakciót EDTA hozzáadásával leállítjuk. A reakcióelegyet fenol- kloroform eleggyel, majd dietil-éterrel extraháljuk, és az oligo(dC)-végű dscDNS-t etanolból végzett kicsapással viszanyeijük. Az oligo(dC)-végű dscDNS-t 0,2 mikrogramm/ml végkoncentrációban 1 mmól/1 EDTA-t és 100 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 7,4) oldjuk. (4) Oligo(dG)-végű pBR322 plazmid DNS előállítása 10 mikrogramm pBR322-t 100 mikroliter, 10 mmól/1 magnézium- kloridot, 50 mmól/1 ammóniumszulfátot és 10 mikrogramm marha szérumalbumint tartalmazó, 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl- pufferben (Ph 7,4) oldunk, és hozzáadunk 15 egység PstI restrikciós endonukleázt. Az elegyet 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk. A reakció leállítása után a reakcióelegyet fenol- kloroform eleggyel extraháljuk, és a kapott DNS-t etanolból kicsapva a vizes fázisból visszanyerjük. A kapott DNS-t 200 mikroliter, a dscDNS oligo(dC)-véggel való kapcsolására használt pufferével azonos összetételű, de 80 egység terminális dezoxinukleotidil-transzferázt és 3H-dCTP helyett 3H- dGTP- t tartalmazó pufferoldatban oldjuk, és 37 °C-on 20 percen át inkubálva kialakítjuk a kb. 10-15 dG-ből álló végcsoportot. A reakcióelegyet fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, az oligo(dG)-végű pBR322 plazmid DNS-t etanolból végzett kicsapás után a vizes fázisból visszanyerjük. A kapott, oligo(dG)- végcsoportot tartalmazó plazmid DNS-t az oligo(dC)-végű dscDNS oldására használt pufferével azonos összetételű pufferben oldjuk, 2 mikrogramm/ml végkoncentrációban. (5) Rekombináns plazmid előállítása 50 mikroliter oligo(dC)-végű cDNS-oldatot 50 mikroliter oligo(dG)-végű pBR322 DNS-oldattal elegyítünk, és az elegyet 65 °C-on 10 percen át, 57 °C-on 120 percen át, 45 °C-on 60 percen át, 35 °C-on 60 percen át végül szobahőmérsékleten 60 percen át in-, kubálva hókezeljük, és kialakítjuk a rekombináns plaz-, midokat. (6) Transzformánsok kiválasztása A fenti (5) pontban kapott rekombináns plazmiddal E. coli %1776 sejteket transzformálunk. Közelebbről, az E. coli X 1776-t 37 °C-on 20 ml, 100 mikrogramm/ml diamino-pimelinsavval és 40 mikrogramm/ml timidinnel kiegészített L-táptalajban tenyésztjük, míg a tenyészet zavarossága 600 nm-en eléri a 0,5 értéket. A sejteket 0 °C-on centrifugálással összegyűjtjük, és 50 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmazó, 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,3) mossuk. A sejteket 2 ml fenti összetételű pufferben újraszuszpendáljuk, és 0 °C-on 5 percen át állni hagyjuk. A szuszpenzió 0,2 ml-éhez 0,1 ml fent kapott rekombináns plazmidoldatot adunk. Az elegyet 0 'C- on 15 percen át állni hagyjuk, majd 2 percen át 42°C- on tartjuk. Ezután hozzáadunk 0,5 ml fenti összetételű kiegészített L- táptalajt, és a sejteket rázatás közben 1 órán át tenyésztjük. A tenyészetből vett alikvot mintát 15 mikrogramm/ml tetraciklint tartalmazó L-tápközeges agarlemezre rétegezzük, és 37 °C-on 12 órán át tenyésztjük. A tetraciklinre rezisztens transzformánsokat kiválasztjuk, és ezeket használjuk cDNS génállományként. (7) Hibridizációs vizsgálat A telep-hibridizációt Hanahan és Meselson módszerével végezzük, mintaként 32P-jelzett cDNS-t haszná-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 27
