202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 lünk, és kiválasztjuk azokat a transzformánsokat, amelyek nyúl TNF-et kódoló cDNS-t tartalmaznak. A pozitív és negatív indukciós, 32P-ral jelzett sscDNS mintákat a fenti (2) pontban leírtak szerint szintetizáljuk, az (1) pontban leírt módon pozitív és negatív indukciós alveoláris makrofágokból nyert mRNS-eket használva, azzal az eltéréssel, hogy nagy fajlagos aktivitású 32P-dCTP-t használunk. A fenti vizsgálat során kiválasztjuk azokat a transzformáns-telepeket, amelyek olyan rekombináns plazmidot fogadtak be, amely a pozitív indukciós mintával erósen hibridizál, de a negatív indukciós mintával nem hibridizál. A közel 20 000 telep közül 50 ilyen telepet szelektáltunk. Az 50 szelektált telep közül 20 telepet ezután mRNS hibridizációs-transzlációs vizsgálatnak vetünk alá, T. Maniatis és munkatársai [(szerkesztő), „Molecular Cloning”, 329 (1980), Cold Spring Harbor Lab.] módszere szerint. Az egyes transzformánsokból extraháljuk a plazmid DNS-t, és hődenaturálás után nitrocellulóz szűrőkre visszük. A szűrőre visszük az (1) pontban leírt módon előállított nyúl TNF mRNS-t tartalmazó poli(A)mRNS-frakciót, és 50 °C-on 3 órán át inkubálva végrehajtjuk a hibridizálást. A hibridizált mRNS-t visszanyerjük, és oocitákba injektáljuk annak kimutatására, hogy a visszanyert mRNS valóban nyúl TNF mRNS-e. A vizsgálat eredményeként 3 olyan telepet szelektáltunk, amelyekben olyan cDNS-t tartalmazó plazmid volt, amely erősen hibridizált a nyúl TNF mRNS-sel. A legnagyobb méretű cDNS-t (kb. 750 bázispárt) tartalmazó plazmidból Ddel restrikciós endonukleázos emésztéssel kapón cDNS-fragmenseket használjuk mintaként a további vizsgálatban. A fenti DNS-fragmenseket 32P-ral jelezzük. A fenti mintákat használva a (6) pontban kapott cDNS génállományt telep-hibridizációs vizsgálatnak vetjük alá, és kiválasztjuk azokat a telepeket, amelyek a jelzett mintákkal erősen hibridizálódó cDNS-eket tartalmazó plazmiddal rendelkeznek. A fenti vizsgálatban a cDNS génállományt tartalmazó 60 000 telep közül 98 telep bizonyult megfelelőnek. A rekombináns plazmid DNS-t izoláljuk és belőlük PstI restrikciós endonukleázos emésztéssel kivágjuk a betoldott cDNS-eket, és poliakrilamid gélelektroforézissel meghatározzuk azok méretét. 17 olyan transzformáns kiónt szelektálunk, amelyben legalább 1000 bázispárból álló betoldott cDNS van. A legnagyobb méretű cDNS-t tartalmazó transzformánsból (transzformáns száma: xl776/pRTNF802; plazmid száma: pRTNF802) izoláljuk a klónozott cDNS-t, és bázisszekvenciáját az alábbi módszerrel meghatározzuk. (8) Klónozott cDNS bázisszekvenciájának meghatározása A fenti (7) pontban leírt módon szelektált Xl776/pRTNF802 transzformánst diamino-pimelinsavval és timidinnel kiegészített L-táptalajban tenyésztjük. A sejteket Wilkie és munkatársai módszere szerint kezelve plazmid DNS-t kapunk. A plazmid DNS-t PstI restrikciós endonukleázzal emésztjük, és tisztítjuk, a klónozott cDNS előállítása céljából. A klónozott cDNS-fragmenst különféle restrikciós endonukleázokkal tovább emésztjük, és a megfelelő, restrikciós endonukleázzal hasított fragmensek bázisszekvenciáját Maxam-Gilbert módszerrel meghatározzuk. A fenti módon meghatározott bázisszekvenciát a 9. táblázatban ismertetjük. A 277-738. bázisokból álló bázisszekvencia kódolja a 2. referenciapélda szerint nyúlplazmából tisztított TNF N-terminális és C-terminális aminosavszekvenciájának megfelelő biológiailag aktív nyúl TNF-et. A 34-276. bázisok alkotják azt a bázisszekvenciát, amely feltehetőleg a prekurzor nyúl TNF felépítéséhez szükséges polipeptidet kódolja. 5 10 15 20 25 30 35 9. táblázat 10 20 30 GGGGGGGGGGGGGGGCCCÍCTGGAGAGAGC 40 50 60 GCCATGAGCÁ CTGAGAGTAT GATCCGGGAC MetSerThrGluSerMetlleArgAsp 70 80 90 GTCGAGCTGGCGGAGGGGCC GCTCCCCAAG ValGluLeuAlaGluGlyProLeuProLys 100 110 120 AAGGCAGGGG GGCCCCAGGG CTCCAAGCGC LysAlaGlyGlyProGlnGlySerLysArg 130 140 150 TGCCTCTGCC TCAGCCTCTT CTCTTTCCTG CysLeuCysLeuSerLeuPheSerPheLeu 160 170 180 CTCGTGGCTGGAGCCACCACGCTCTTCTGC LeuValAlaGlyAlaThrThrLeuPheCys 190 200 210 CTGCTGCACTTCAGGGTGATCGGCCCTCAG LeuLeuHisPheArgValíleGlyProGln 220 230 240 GAGGAAGAGCAGTCCCCAÁACAACCTCCAT GluGluGluGlnSerProAsnAsnLeuHis 28
