202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 A kapott lizátumot használjuk fel a tisztított humán TNF polipeptid előállítására. (2) Humán TNF polipeptid tisztítása A humán TNF polipeptidet az (1) pontban leírtak szerint kapott lizátumból a következők szerint tisztítjuk. 5*20 cm-es, előzőleg 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,8) ekvilibrált DEAE-Sepharose CL-6B-vel (Pharmacia) töltött oszlopra 1030 ml lizátumot viszünk fel. Az oszlopot 3 liter azonos pufferrel mossuk, majd 133 ml/óra átfolyási sebesség mellett a fenti pufferben 0-0,3 mól/1 lineáris koncentrációgradiensű nátrium- kloriddal eluáljuk. Az eluátumból 10 mles frakciókat gyűjtünk. A citotoxikus aktivitással rendelkező frakciókat összegyűjtjük és félretesszük. A fenti lépésben a citotoxikus aktivitás 53%-át nyerjük vissza, a fajlagos aktivitás közel 9-szeresére növekedik. A félretett frakciókat sómentesítjük, és ultraszűréssel [Diaflo, YM10 membrán (Amicon)] eredeti térfogatának 10-ed részére koncentráljuk. A koncentrátumot preparatív méretű izoelektromos fókuszáló gél- elektroforézisnek vetjük alá. Akoncentrátum egy alikvot mennyiségét 0,2*10*10 cm-es poliakrilamid géllemezre visszük, és Immobiline-nel (LKB) pH 5,6-pH 6,1 értékek közé eső pH-gradienst biztosítunk. Az elektroforézist 2400 V mellett, 15 ’C- on 16 órán át folytatjuk. A gélt 10 mm széles csíkokra vágjuk, és a proteint 20 mmól/1 koncentrációjú Tris- HCl-pufferrel (pH 7,8) eluáljuk. A fenti műveletet megismételjük. A citotoxikus aktivitással rendelkező eluátumokat összegyűjtjük, és ultraszűréssel koncentráljuk, a fenti módon. Végül a koncentrátumot 0,7*25 cm- es, Bio-gel P-6 (BIO-RAD) töltetű oszlopra visszük, és sómentesítjük. A sómentesített végtermék citotoxikus aktivitása SDS- poliakrilamid gél-elektroforézises vizsgálat alapján homogén, és azt a [III) fejezetben említettek szerint mint tisztított humán TNF polipeptidet vizsgáltuk. 6. példa Liofdizált humán TNF polipeptid előállítása Az 5. példa szerint előállított tisztított humán TNF polipeptid oldatot használjuk a liofilizált humán TNF polipeptid előállítására. 10 ml 2,2* 107 egység (LM)/ml) citotoxikus aktivitással rendelkező tisztított humán TNF polipeptid oldatot 0,1 térfogatnyi 0,8%-os, 10% humán szérumalbumint és 20% D-mannitot tartalmazó nátrium-klorid-oldattal elegyítünk. Az oldat pH-ját 6,8-ra állítjuk, majd a kapott oldatot Microflow membránon (Flow Labs., pórusméret: 0,2 mikron) átszűrve sterilizáljuk. 5 ml steril oldatot üvegcsőbe töltünk, és liofilizáljuk. Minden egyes cső 10'egység (LM) tisztított humán TNF polipeptidet tartalmaz. 1. referenciapélda Nyúl TNF cDNS előállítása (1) TNF mRNS előállítása nyúl alveolusz makrofágokból Közel 2,5 kg-os nyulaknak intravénásán 100 mg/nyúl dózisban elölt, száraz Propionibacterium acnes sejteket injektálunk, majd az állatokat 8 nap múlva leöljük. A tüdőt az állat légcsövébe illesztett cső segítségével foszfáttal pufferolt sóoldattal többször átmossuk, és az alveoláris makrofágokat összegyűjtjük. 12 nyúlból körülbelül 3*109 alveoláris makrofágot kapunk. Az alveoláris makrofágokat 10% magzati marhaszérumot tartalmazó RPMI-táptalajban szuszpendáljuk, és 2*107 sejt/csésze sejtkoncentrációt biztosítva 8 cm átmérűjő Petri-csészére oltjuk. A sejteket 5% szén-dioxidot tartalmazó, telített páratartalmú légtérben 37 °C- on előtenyésztjük. 1 órás előtenyésztés után 10 mikrogramm/ml végkoncentrációban endotoxint (E. coliból származó lipopoliszacharidot), 10 ng/ml végkoncentrációban TPA-t (forbol-12- mirisztát-13-acetátot) és 1 mikrogramm/ml végkoncentrációban cikloheximidet adunk a tenyészethez. A tenyésztést 4-4,5 órán át (azaz összesen 5-5,5 órán keresztül) folytatjuk, a táptalajt leszívatjuk, és a csészéhez tapadt makrofágokat 0,6% nátrium- lauroil-szarkozinátot és 6 mmól/1 nátrium-citrátot tartalmazó 5 mól/1 koncentrációjú guanidil-tiocianát-oldatban homogenizáljuk. A homogenizátumot 0,1 mól/1 EDTA-t tartalmazó, 5,7 mól/1 koncentrációjú cézium-klorid-oldatra visszük, és ultracentrifugában (Hitachi Koki, RPS27-2 rotor) 26 500 fordulat/perc sebességgel 20 órán át centrifugáljuk. Az össz-RNS- frakciót szemcsés formában kapjuk. A szemcséket kis mennyiségű, 0,35 mól/1 nátrium-kloridot, 20 mmól/1 Tris-HCl-puffert (pH 7,4) és 20 mmól/1 EDTA-t tartalmazó, 7 mól/1 koncentrációjú karbamidoldatban oldjuk, majd etanolból kicsapva visszanyerjük. 12 nyúlból 5,2 mg össz-RNS-t kapunk. A össz-RNS-frakciót 2 ml, az 1-(1). példában használt TE-oldatban oldjuk, és az oldatot 65 °C-on 5 percen át melegítjük. 0,5 mól/1 koncentrációban nátriumklorid-oldatot adunk hozzá, és az oldatot előzőleg 0,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó TE-oldattal ekvilibrált oligo(dT)-cellulóz-oszlopra visszük. Az oszlopról TE- oldattal eluáljuk a poli(A)-mRNS-t, a hozam 314 mikrogramm. 200 mikrogramm kapott poli(A)-mRNS- t 6 mmól/1 karbamid jelenlétében 1% gélkoncentrációt alkalmazva, pH 4 értéken agaróz gél- elektroforézisnek vetünk alá, és a molekulaméretnek megfelelően 7 frakcióra választjuk szét. A poli(A)mRNS-t minden egyes gélfrakcióból úgy nyerjük ki, hogy a gélt 70 °C-on 10 percen át melegítve megolvasztjuk, fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, és etanolból kicsapjuk. Az egyes frakciókból visszanyert poli(A)mRNS nyúl TNF mRNS tartalmát Xenopos laevis oocitáit használva mRNS transzlációs vizsgálattal határozzuk meg. A nyúl TNF mRNS-t nagyobb koncentrációban az 1600-2700 bázispámak megfelelő méretű frakcióból nyerjük vissza, melyet a továbbiakban nyúl TNF mRNS-ben feldúsult frakciónak nevezünk. A nyúl TNF mRNS-ben feldúsult frakciót az alábbi kísérletben használjuk fel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 26
