202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 mezen a 16500 móltömegnek megfelelő helyen lévő protein erős citotoxikus aktivitással rendelkezik. A pHTS37 expressziós plazmid szerkezete alapján feltételezhető, hogy a transzformált sejtekben termelt humán TNF polipeptid egy fuzionált protein, amely foszfát-kötő protein egy részéből és prekurzorának egy részét tartalmazó humán TNF polipeptidből áll. A fuzionált protein számított molekulatömege közel 23 000. A biológiailag aktív humán TNF polipeptid molekulatömege viszont 17 097. A fenti vizsgálati eredmény szerint a kapott fuzionált proteint a gazdasejtben korlátozott hidrolízissel biológiailag aktív humán TNF polipeptiddé alakíthatjuk, valószínűleg egy specifikus helyen (Aig-Ser) való hasítással, ahol a biológiailag aktív humán TNF polipeptid a prekurzor-részhez kapcsolódik. Ha a periplazmás extraktumot 5 mikrogramm/ml tripszinnel (marha pankreászból előállított, Sigma Chemical Co.) 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk, és a reakcióelegyet SDS-poli-akrilamid gél- elektrofoiézisnek vetjük alá a fenti körülmények között, a 22 000 molekulatömegnek megfelelő helyzetben korábban kimutatott protein-sáv - amely valószínűleg a fuzionált protein sávja - nem észlelhető, a tripszines emésztés következtében eltűnik. 3. példa Módosított humán TNF polipeptid előállítása A biológiailag aktív humán TNF polipeptid N-terminális végéről négy aminosav törlésével kapott polipeptidet kódoló DNS-t hordozó pHTRD4 expressziós plazmidot lényegében a 2-(2). példában a pHTR91 expressziós plazmid előállítására szolgáló eljárással állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy az I. adapter helyett az 5 ’ -CG ATATG ACC 3 ’ -TATACTGGGGCT képletű szintetikus adaptert használjuk. A fenti adapter használata esetén az iniciációs kodont (ATG) követő bázisszekvencia egy olyan 151 aminosavból álló polipeptidszekvenciát kódol, amely a biológiailag aktív humán TNF polipeptid N-terminálisán lévő négy aminosav (Ser-Ser-Ser- Arg) törlésével keletkezik. A fenti eljárással előállított pHTRD4 expressziós plazmidot E. coli HB101 sejtekbe visszük be, és a kapott transzformánst egy éjszakán át 37 °C-on, módosított M-9 táptalajban tenyésztjük. A tenyészet 0,05 ml-ét 5 ml azonos táptalajba oltjuk, és 37 °C-on 1 órán át tenyésztjük. Ezután 20 mikrogramm/ml végkoncentrációban 3-ß-indolakrilsavat adunk a tenyészethez, és a tenyésztést egy éjszakán át tovább folytatjuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, és a 2-(l). példában leírtak szerint kezelve tiszta lizátumot állítunk elő. A lizátum citotoxikus aktivitása 1,1* 105 egység (L- 929)/ml. 4. példa Humán TNF prekurzor polipeptid előállítása Escherichia coli-ban A humán TNF prekurzor polipeptidet kódoló cDNS- t hordozó pHTRP3 expressziós plazmidot a következők szerint állítjuk elő. A pHT113 rekombináns plazmidból kettős, PstI és Hindin restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel nyert klónozott cDNS-t HgiAI restrikciós endonukleázzal részlegesen tovább emésztve olyan - kb. 820 bázispárból álló - DNS-fragmenst kapunk, amely a prekurzor polipeptid nagy részét kódoló bázisszekvenciát magában foglalja. A kapott DNS-fragmenst kémiailag szintetizált, 5 ’ -CGATATGAGCA 3’-TATAC képletű oligodezoxiribonukleotiddal kapcsoljuk össze. Az összekapcsolással nyert DNS-fragmenst a továbbiakban Pre-TNF-fragmensnek nevezzük. Fentiektől függetlenül, a pDR720 plazmidból EcoRI és Hpal restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel egy, a trp promoter régió egy részét tartalmazó DNS-fragmenst vágunk ki, és a kapott DNS-fragmenst kémiailag szintetizált, 5 ’-AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAG GGTAAT 3 ’-TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTnTCCC ATTAGC képletű adapterrel kapcsoljuk össze. A kapott DNS-fragmenst Pre-TNF-fragmenssel kapcsoljuk össze, és az összekapcsolt DNS-fragmenst egy, a pBR322 plazmidból EcoRI és HindlII restrikciós endonukleázos emésztéssel izolált, ampicillin-rezisztencia gént tartalmazó, kb. 4300 bázispárból álló DNS- fragmenssel kapcsoljuk össze. A fenti eljárással előállított pHTRP3 expressziós plazmidot E. coli HB101 sejtekbe visszük be, és a transzformált sejteket egy éjszakán át 37 °C-on, módosított M-9 tápközegben tenyésztjük. A tenyészet 0,05 ml-ét 5 ml azonos táptalajba oltjuk, és a sejteket 1 órán át 37 "C-on tenyésztjük. A tenyészethez ezután 20 mikrogramm/ml végkoncentrációban 3-ß-indolakrilsavat adunk, és a tenyésztést egy éjszakán át tovább folytatjuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, és a 2-(l). példában leírtak szerint kezelve tiszta lizátumot állítunk elő belőlük. A lizátum citotoxikus aktivitása 1,8*104 egység (L- 929)/ml. 5. példa Humán TNF polipeptid előállítása és tisztítása (1) Polipeptid előállítása Escherichia coli-ban A humán TNF polipeptid előállítására a 2-(2). példa szerint előállított HB101/pHTR91 transzformánst használjuk. A transzformánst egy éjszakán át 12,5 mikrogramm/ml tetraciklinnel kiegészített LB-tápközegben 37 °C-on tenyésztjük. A tenyészetet 10 ml, a 2-(2). példában is használt, módosított M-9 tápközegbe oltjuk, és 37 °C-on 1 órán át tenyésztjük. A tenyészethez 20 mikrogramm/ml végkoncentrációban 3-ß-indolakrilsavat adunk, és a tenyésztést 4 órán át tovább folytatjuk. A sejteket a 2-(l). példában ismertetett módon összegyűjtjük, és tiszta lizátumot állítunk elő belőlük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 25
