202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 poli(A) poliadenilsav poli(U) poliuridilsav poli(dC) polidezoxicitidilsav poli(dG) polidezoxiguanilsav ATP adenozin-trifoszfát EDTA etiléndiamin-tetraecetsav kb kilobázis (ezer bázis) kbp kilobázispár bp bázispár Meth A szarkóma metil-kolantrénnel indukált szarkóma TNF tumor nekrózis faktor rHu-TNF rekombináns humán TNF A leírásban az egyszálú bázisszekvencia az értelmes 15 szál bázisszekvenciáját jelenti, és a bal vége az 5’-vég, a jobb oldali a 3’-vég. Az aminosavszekvenciában a bal oldali vég az N-terminális, a jobb oldali vég a C- terminális. A találmány szerinti eljárást részleteiben, az előz- 20 ményeket is beleértve az alábbiakban ismertetjük. [1-1] Nyúl TNF-et kódoló DNS, és a nyúl TNF Rekombináns DNS technológiát alkalmazva sikerült kutatásaink során klónozni a nyúl TNF-et kódoló 25 cDNS-t, és felderíteni a nyúl TNF szerkezetét. Közelebbről, nyúl makrofágokat in vitro megfelelő indukáló anyagokkal együtt tenyésztettünk, megbizonyosodtunk róla, hogy nyúl TNF keletkezett és a táptalajba ürült. Ezt követően olyan tenyésztési körülményeket 30 kerestünk, amelyek között a makrofágokban nagy koncentrációban képződött és felhalmozódott a nyúl TNF 1-1. táblázat: (1-1) képletű DNS-szekvencia mRNS. Ezután sikerült klónoztunk a nyúl TNF-et kódoló cDNS-t, és meghatároznunk bázisszekvenciáját, és azt is kimutattuk, hogy a nyúl TNF mint prekurzor keletkezik. Sikerült továbbá klónozott cDNS-t hordozó expressziós vektort bevinnünk egy gazdaszervezetbe, és ott nyúl TNF-et termelni. A nyúl TNF-et kódoló cDNS-t és a nyúl TNF-et részletesen például a 677 680 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és a 84 114 325.8 számú európai szabadalmi leírás ismerteti. Lényegüket az alábbiakban foglalhatjuk össze. A biológiailag aktív nyúl TNF-et kódoló jellegzetes DNS-szekvenciát az 1-1. táblázatban közölt (1-1) képlet jellemzi. Az (1-1) képletű bázisszekvenciával rendelkező DNS az 1-2. táblázatban közölt (1-2) képletű polipeptidet kódolja. A nyúl TNF-et kódoló DNS kódolja a nyúl TNF egy prekurzorát. A nyúl TNF perkurzorát kódoló jellegzetes DNS szerkezetét a 2-1. táblázatban megadott (2-1) képlet jellemzi, vagy egy olyan DNS, amelyet úgy kapunk, hogy a DNS 5’-végéhez egy ATG triplettet adunk. A (2-1) képletű bázisszekvenciát tartalmazó DNS a 2-2. táblázatban ismertetett (2-2) képletű polipeptidet kódolja. Az (1-2) képletű aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid, azaz a biológiailag aktív nyúl TNF nem faj-specifikus, és tumorellenes szerként használható, mivel tumorsejtekkel szemben szelektív citotoxikus hatást fejt ki, és tumoros állatokban a tumort visszafejleszti. (5> TCA GCT TCT CGG GCC CTG AGT GAC AAG CCT CT A GCC CAC GTA GTA GCA AAC CCG CAA GTG GAG GGC CAG CTC CAG TGG CTG AGC CAG CGT GCG AAC GCC CTG CTG GCC AAC GGC ATG AAG CTC ACG GAC AAC CAG CTG CTG GTG CCG GCC GAC GGG CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTT CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC GCG TCC TAC GTG CTC CTC ACT CAC ACT GTC AGC CGC TTC GCC GTC TCC TAC CCG AAC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAC CGG GAC ACC CCC GAG GAG GCT GAC CCC ATG GCC TGG TAC GAG CCC ATC TAC CTG GGC GGC GTC TTC CAG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC AGC ACC GAG GTC AAC CAG CCT GAG TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC TIT GGG ATC ATT GCC CTG-(3 ’) 1-2. táblázat: (1-2) képletű polipeptid Ser Ala Ser Arg Ala Leu Ser Asp Lys Pro Leu Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Val Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Ser Gin Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Lys Leu Thr Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Ser Gly Gin Gly Cys Arg Ser Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe 3
