202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 rint transzformáljuk. Ezután a transzformált sejtek tenyésztésével előállíthatjuk a humán TNF polipeptidet, vagy egy olyan fenti polipeptidet, amelynek N-terminálisán metionin van. A termék vagy a gazdaszervezet citoplazmájában, vagy a periplazmájában halmozódik fel, attól függően, hogy az expressziós vektort milyen módszerrel szerkesztettük meg. Abból a célból, hogy a polipeptid a periplazmába választódjon ki, egy szekréciós protein génjének - például egy lúgos foszfatáz génnek (phoA) vagy foszfát-kötő protein génnek (phoS) felhasználásával úgy szerkesztjük meg az expressziós vektort, hogy a humán TNF polipeptidet kódoló DNS-t a helyes transzlációs leolvasó rendben a fenti génhez kapcsoljuk, egy megfelelő helyen, a szignál-peptidet kódoló DNS-régiót követően. A kapott transzformált sejteket ezután az azok tenyésztésére alkalmas körülmények között tenyésztjük, míg a kívánt polipeptid megfelelő mennyiségben termelődik. Mikor a termelt polipeptid a citoplazmában felhalmozódott, a gazdasejteket elroncsoljuk - például lizozimes emésztéssel, és fagyasztással és felolvasztással, vagy ultrahangos kezeléssel, vagy egy French prést alkalmazva -, majd centrifugálással vagy szűréssel összegyűjtjük az extraktumot. Ha a termék a periplazmában halmozódott fel, onnan extraháljuk, például Willsky és munkatársai [J. Bacteriol., 127, 595 (1976)] módszere szerint. A kapott nyers pepiidet ezután ismert módon tisztítjuk, például a kisózás, ultraszűrés, dialízis, ioncserélő kromatográfia, gélszűrés, elektroforézis, affinitási kromatográfia, stb. kombinálásával. A fenti eljárással humán TNF-polipeptidet és/vagy olyan polipeptidet állíthatunk elő, amely az N-terminálison metionint tartalmaz. A humán TNF polipeptidtől, és az N-terminálison metionint tartalmazó polipeptidtől eltérő polipeptideket is előállíthatunk a találmány szerinti eljárással, a kívánt DNS-t lényegében a fentiek szerint használva, vagy ismert eljárások megfelelő kombinálásával. (2) Humán TNF polipeptid módosítása Módosított humán TNF polipeptidek alatt a humán TNF polipeptidet kódoló DNS alléi mutánsaiból származtatható polipeptideket (alléi mutáns polipeptidek); a humán TNF polipeptid vagy az alléi mutáns polipeptid C- vagy N-terminálisához egy aminosav, vagy két vagy több aminosavat tartalmazó peptid hozzáadásával nyert polipeptideket; a humán TNF polipeptidből vagy alléi mutáns polipeptidből egy vagy több aminosav törlésével nyert polipeptideket (például a humán TNF polipeptid N-terminálisán 4 aminosav törlésével nyert polipeptidet, melyet a [III-l] fejezetben a (6) pontban ismertetünk); A humán TNF polipeptid, vagy alléi mutánsának módosítását például Means, G.E. és Feeney, R.E. módszerével [’’Chemical Modification of Proteins,,, Holden-Day, Inc. California (1971)] végezhetjük el, önmagában ismer módon. [III] A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek jellegzetes képviselőinek kémiai és fizikaikémiai tulajdonságait, biológiai aktivitását és immunológiai tulajdonságait az alábbiakban ismertetjük. A 4. példa szerint előállított, tisztított humán TNF polipeptid (továbbiakban rekombináns humán TNF, rövidítve rHU-TNF) tulajdonságait az alábbiakban ismertetjük. [in-1] Kémiai és fizikai-kémiai tulajdonságok (1) Molekulatömeg Az rHu-TNF molekulatömegét gélszűréssel határoztuk meg, TSK-gélen, G3000 SW oszlopon (7,5*600 mm, Toyo Soda), nagynyomású folyadékkromatográfiás technikát alkalmazva, oldószerként 0,2 mól/1 koncentrációjú foszfát-puffért (pH 7) használtunk, 8 mól/1 karbamid és 0,5% 2-merkapto-etanol-tartalom mellett, vagy anélkül. Ismert molekulatömegű proteinként marha szérumalbumint (móltömeg 6,6* 104), nyúl triózfoszfát-izomerázt (móltömeg 5,3»]04), ovalbumint (móltömeg 4,5* 104), sertés pepszint (móltömeg 3,27‘lű4), szója tripszin-inhibitort (móltömeg 2,05’lű4), ló mioglobint (móltömeg 1,78*104) és ló citokróm C-t (móltömeg 1,24* 104) használtunk. Vizsgálataink szerint a rHu-TNF relatív mőltömege 45 000 ± 5000 dalton, karbamid és 2-merkapto-etanol távollétében, és 18 000 ± 3000 dalton, azok jelenlétében. A pHTR91 expressziós plazmidba illesztett cDNS egy 155 aminosavból álló peptidláncot kódol (az iniciációs ATG kodonnak megfelelő metionint elhagyva). A rHu-TNF elméletileg számított molekulatömege 17 097 dalton, az aminosavszekvencia alapján. A számított molekulatömeg egyezik a karbamid és 2-merkapto-etanol jelenlétében mért molekulatömeggel. A fenti eredmények azt mutatják, hogy a rHu-TNF karbamid és 2-merkapto-etanol jelenlétében monomerként (alegység) van jelen, míg a denaturálószerek távollétében aggregátumot - például fcrimert - képez. (2) Izoelektromos pont Az izoelektromos pontot izoelektromos fókuszáló gél-elektroforézissel határoztuk meg, 3 watt mellett, 3 órán át, 5%-os poliakrilamid géllemezt használva, pH 4,0 - pH 6,5 tartományba eső pH-gradienssel, melyet Pharmalyte-tel (Pharmacia) állítottunk elő. A proteint Coomassie brilliant blue festékkel festettük meg. Egy másik gélt 3 mm széles csíkokra vágtunk, és a proteint 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl (pH 7,8) pufferoldatba merítve eluáltuk. Citotoxikus aktivitást azokból a gélszeletekből származó eluátumokban észleltünk, amelyek helyzete megegyezett a festéssel detektált protein helyzetével. A rHu-TNF izoelektromos pontja vizsgálataink szerint 5,9 ± 0,3. (3) Aminosav-összetétel A rHu-TNF aminosav-összetételét mikro-aminosavanalizátorban (Shimadzu Seisakusho) határoztuk meg, fluorometriás módszerrel, a mintát hidrogén-kloridos hidrolízis ortoftálaldehiddel kezelve. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60. 16
