202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 50 mikrogramm rHu-TNF-et 6 n hidrogén-kloridoldattal 110 °C-on hidrolizáltunk. Az aminosav-tartalmat úgy számítottuk ki, hogy a mért értékeket a 24, 48 és 72 órán át hidrolizált mintában meghatározott értékek alapján korrigáltuk. A cisztint (vagy ciszteint) ciszteinsav formájában határoztuk meg, peihangyasavas oxidáció után. A triptofánt fluormetriásan mértük, Pajot [Eur. J. Biochem., 63, 263 (1976)] módszere szerint. Az eredményeket a 7. táblázatban foglaltuk össze. 7. táblázat Aminosav Relatív moláris mennyiség Asp + Asn 12,1 Thr 5,5 Ser 12,4 Glu + Gin 20,3 Pro 10,3 Gly 10,6 Ala 13,0 Cys 1,5 Val 12,1 Met <0,1 lie 8,0 Leu 17,7 Tyr 6,8 Phe 3,9 His 2,8 Lys 6,1 Arg 7,5 Trp 1,6 Az aminosav-összetétel jól egyezik a humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvencia alapján következtetett összetétellel. 4 (4) N-terminális aminosavszekvencia meghatározása A rHu-TNF N-terminális aminosavszekvenciáját Edman-lebontással határoztuk meg Arch. Biochem. Biophys., 22, 475 (1949). Az N-terminális aminosav Edman-lebontásával nyert fenil- tiohidantoin-aminosavat nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással azonosítottuk, TSK- gél 120A-val (Toyo Soda) töltött 4,6*250 mm-es oszlopot használva. A fenti eljárást sorozatosan megismételve meghatároztuk az újonnan kialakult N-terminális aminosavakat, szekvenciálisán. Vizsgálataink szerint a rHu-TNF N-terminális aminosavszekvenciája az alábbi: NH2-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp— Ismert, hogy számos, rekombináns DNS-technikával mikroorganizmusokban előállított polipeptid metionin-aminosavmaradékot tartalmaz az N-terminális végen, ami az iniciációs kodonból (ATG) származik. Az 5. példa szerint előállított rHu-TNF esetén azonban nem lehetett az N-terminálison metionint kimutatni, az onnan teljesen el lett távolítva. (5) C-terminális aminosavszekvencia meghatározása A rHu-TNF C-terminális aminosavszekvenciáját enzimatikus lebontással határoztuk meg, karboxipeptidázt használva. A rHu-TNF-et karboxipeptidáz-A-val és karboxipeptidáz-Y-nal emésztettük, az enzim: szubsztrát mólarány 1:25, illetve 1:1000 volt. A rHu-TNF C-terminálisáról felszabaduló aminosavakat mikro-aminosavanalizátorral (Shimadzu Seisakusho) azonosítottuk, megfelelő időközönként (2 perc - 180 perc, az emésztés kezdetétől számítva) vett mintákban. Vizsgálataink szerint a rHu-TNF C-terminális aminosavszekvenciája az alábbi: —Tyr-Phe-Gly-Ile-Ala-Leu-COOH (6) rHu-TNF tripszines emésztése 500 mikrogramm rHu-TNF-et 20 mikrogramm TPCK-kezelt tripszinnel (XIII. típus, SIGMA Chemical Co.) emésztettünk, 5 mmól/1 koncentrációjú Tris- HC1 pufferoldatban (pH 7,8), szobahőmérsékleten, 5 órán keresztül. A kapott terméket a 4. példa (2) lépésben leírtak szerint preparatív izoelektromos fókuszáló gél-elektroforézisnek vetettük alá. A proteineket Coomassie brilliant blue-val festettük. Egy másik lemezt 3 mm széles csíkokra vágtunk, és a proteint 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 7,8) eluáltuk. Vizsgálataink szerint a rHu-TNF izoelektromos pontjánál kb. 0,3 pH-értékkel alacsonyabb pH értéknek megfelelő zónából eluált emésztett terméknek volt citotoxikus aktivitása. A citotoxikus aktivitással rendelkező emésztett terméknek a fentebb ismertetett módon meghatároztuk a C-terminális és N-terminális aminosavszekvenciáját. Vizsgálataink szerint az emésztett termék részleges aminosavszekvenciája az alábbi: N-terminális: NH2-Thr-Pro-Ser-Asp— C-terminális: —Ile-Ala-Leu-COOH. Az aminosavszekvenciából következtetve az emésztett termék egy olyan polipeptid, amely a rHu-TNF-ből négy N-terminális aminosav lehasadásával keletkezik, és citotoxikus aktivitással rendelkezik. Ez azt jelenti, hogy a rHu-TNF N-terminális végén levő négy aminosav nem lényeges a biológiai aktivitás szempontjából. [HI-2] Biológiai aktivitás (1) Egér L-M sejtekkel szembeni citotoxikus hatás A citotoxikus aktivitást egér L-M sejtekkel (ATCC, CCL 1.2) szemben az alábbiak szerint határoztuk meg. 0,1 ml mintát az alább említett táptalajjal sorozatban hígítottunk, és a 96 lyukú lemez (Flow Labs.) minden egyes lyukába 0,1 ml 1*105 sejt/ml töménységű L-M sejt szuszpenziót mértünk. Táptalajként Eagle-féle minimáltáptalajt [J. Paule: „Cell and Tissue Culture”, E and S. Livingstone Ltd. (1970)] használtunk, 1% mag-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 17
