202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 3) az olyan (I) általános képletú polipeptidek, amelyek képletében A jelentése (la), B jelentése (Ib), X jelentése (Ic), m és n értéke 1, Y és p jelentése az (I) általános képletre megadott. Különösen előnyös az a polipeptid, amelynek (I) általános képletében A jelentése (la), B jelentése (Ib), m értéke 1 vagy 0, és n és p értéke 0, vagy gyógyászatiig elfogadható sói. Az (la) képletú polipeptidnek a 6. táblázat alsó sorában feltüntetett aminosavszekvencia 86-236. aminosavakból álló szakasza felel meg. Az olyan (la) általános képletú polipeptidekre példaként, amelyekből egy vagy több aminosav hiányzik, vagy egy más aminosavra van cserélve, az alábbiakat említjük: 4) olyan (la) képletú polipeptid, amelyből az N-terminálishoz képest 1. helyzetben lévő Thr hiányzik; 5) olyan (la) képletú polipeptid, amelyből az N-terminálishoz képest 1. helyzetben lévő Thr-tól a 6. helyzetben lévő Pro-ig tartó aminosavszekvencia hiányzik; 6) olyan (la) képletú polipeptid, amelyből az N-terminálishoz képest 1. helyzetben lévő Thr-tól a 9-es helyzetben lévő His-ig tartó aminosavszekvencia hiányzik; 7) olyan (la) képletú polipeptid, amelyből az N-terminálishoz képest 1. helyzetben lévő Thr-tól a 12. helyzetben lévő Ala-ig tartó aminosavszekvencia hiányzik; és 8) olyan (la) képletú polipeptid, amelyben az N-terminálishoz képest 66. helyzetben lévő Thr His-re, a 67. helyzetben lévő His Thr-ra vagy Tyr-ra van cserélve. Véleményünk szerint a biológiai aktivitás szempontjából a polipeptid aminosavszekvenciájából fontos 9) a 6. táblázat alsó sorában a 193. helyzetű Trp-tól a 236. helyzetű Leu-ig tartó aminosavszekvencia, és közelebbről 10) a 6. táblázat alsó sorában a 220. helyzetű Tyr-tól a 236. helyzetben lévő Leu-ig tartó aminosavszekvencia. Az (I) általános képletú polipeptidek aggregátumok formájában, például trimerként is létezhetnek, a fenti aggregátumok természetesen szintén a találmány tárgykörébe tartoznak. A találmány értelmében az (I) általános képletú humán TNF polipeptidet az alábbiak szerint állítjuk elő: A) az (I) általános képletú humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvenciájú DNS-t kívánt esetben egy heterológ polipeptidet kódoló DNS-sel összekapcsolunk, egy expnessziós vektorba illesztjük; B) a rekombináns vektort bevisszük egy gazdaszervezetbe; C) a rekombináns vektorral transzformált gazdaszervezetet tenyésztve előállítjuk a polipeptidet; D) a tenyésztett sejteket összegyűjtjük és a termelt polipeptidet a sejtekből extraháljuk; és E) a polipeptidet a proteinek tisztítására szokásosan alkalmazott eljárásokkal tisztítjuk. (1) Humán TNF polipeptid előállítása A találmány szerinti eljárással előállított DNS segítségével az alábbiak szerint állítjuk elő a humán TNF polipeptidet. A humán TNF polipeptid előállításához szükséges expressziós vektort úgy nyerhetjük, hogy a humán TNF polipeptidet kódoló DNS-t megfelelő vektorba illesztjük. Minden olyan vektor megfelel a fenti célra, amely a transzformálandó mikroorganizmusban proliferál. Példaként a plazmidokat - például E. coli pBR322 plazmid -, fágokat - például fág-származékok -, és a vírusokat - például az SV40 vírust - említjük. A fenti vektrorokat külön- külön, vagy kombinációban alkalmazhatjuk, például pBR322-SV40 hibrid plazmidként. A DNS beillesztésének helyét célszerűen megválaszthatjuk. Más szóval, a megfelelő vektort annak megfelelő helyén egy megfelelő restrikciós endonukleázzal hasíthatunk, ismert módon, és a hasítás helyére beilleszthetjük a megfelelő hosszúságú klónozott cDNS-t. Még pontosabban, a nem fuzionált polipeptid előállítására alkalmas expressziós vektort úgy állítjuk elő, hogy a humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvenciát tartalmazó DNS-fragmenst - amelynek 5’-végéhez egy ATG iniciációs kodon van adva és amely 3’végén egy terminációs kodont (TAA, TAG vagy TGA) tartalmaz - egy megfelelő promoten-el és Shine-Dalgamo-szekvenciával rendelkező DNS-fragmenshez adjuk, és egy vektorba illesztjük. A fuzionált polipeptidek előállítására alkalmas expressziós vektort úgy állíthatjuk elő, hogy a humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvenciát tartalmazó cDNS-t - amelyben a terminációs kodon a 3’-véghez van adva - úgy illesztjük a vektorba, hogy a transzlációs leolvasó szerkezet egybeessen a fuzionálandó strukturális génével. A humán TNF polipeptidet azért előnyös fuzionált polipeptidként előállítani, mert így a transzformált gazdasejtekben minimálisra csökkenthető a termék degradálódása. Ebben az esetben a humán TNF polipeptidet ki kell vágni a fuzionált termékből. A biológiailag aktív humán TNF polipeptid - amely a 6. táblázat felső sorába a 82. helyzetben lévő Ser-tői a 236. helyzetű Leu-ig tartó aminosavszekvenciának felel meg - nem tartalmaz egy metionin-aminosavmaradékot sem. Ezért olyan expressziós vektort alkalmazva, amelyet úgy állítottunk elő, hogy a humán TNF cDNS-fragmenst a fuzionálandó struktúrális gén bázisszekvenciájának 3’végéhez egy metionin- kodonon (ATG) keresőül kapcsoltuk, a fuzionált termékből könnyen visszanyerhetjük a humán TNF polipeptidet a metionin- peptidkötés hasítására alkalmas módszerekkel, például bróm-ciános kezeléssel [Itakura K. és munkatársai: Science, 198, 1054 (1977)]. A promoterekre példaként a lac, trp, tac, phoS, phoA, PL és SV40- t, mint korai promotert említjük. A transzformált sejteket úgy kapjuk, hogy az expressziós vektort egy gazdaszervezetbe - például mikroorganizmusba, állati vagy növényi sejtbe - visszük be. Az E. coli-t például Cohen és munkatársai [Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 69, 2110 (1972)] módszere sze-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15
