202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 A találmány tárgya eljárás 1) humán tumor nekrózis faktor polipeptidnek, vagy annak fő részének vagy részeinek, vagy a humán nekrózis faktor polipeptidet kódoló DNS alléi mutánsából származó polipeptidnek - továbbiakban alléi mutáns polipetid - megfelelő bázisszekvenciát tartalmazó DNS, előállítására; 2) a fenti DNS-t tartalmazó vektor előállítására, a vektor gazdaszervezetbe való bevitelére, és ennek segítségével a DNS-nek megfelelő polipeptid - azaz a humán tumor nekrózis faktornak, vagy annak fő részének vagy részeinek megfelelő polipeptid, vagy egy humán tumor nekrózis faktorhoz hasonló anyag, vagy annak fő része vagy részei, - előállítására a gazdaszervezetben; 3) a fenti polipeptidet vagy anyagokat tartalmazó tumorellenes hatású gyógyszerkészítmények előállítására. Carswell és munkatársai felfedezték, hogy a Calmette-Guérin bacilussal (BCG) fertőzött, majd endotoxinnal kezelt egerek széruma olyan anyagot tartalmaz, amely elöli a transzplantált Meth A szarkómát. A fenti anyagot tumor nekrózis faktornak - továbbiakban TNF - nevezték el [Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 72, 3666 (1975)]. A TNF-et egy, a makrofágokból felszabaduló, fiziológiailag aktív anyagnak tekintik, amelyre az jellemző, hogy i) ha bizonyos fajta tumort - például Meth A szarkómát - hordozó állatnak beadják, a tumort elpusztítja, és az állat meggyógyul; ii) bizonyos fajta tumorsejtekkel - például egér L-sejt - szemben in vitro citotoxikus hatást mutat, míg a normál sejteket alig károsítja; és iii) aktivitása nem faj-specifikus állatban. Fenti tulajdonságai következtében a TNF-et mint új típusú tumorellenes szert érdemes kifejleszteni. TNF-et, illetve TN-szerű anyagot ismertetnek az alábbi irodalmi helyeken: Green és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 73, 381 (1976); Matthews és munkatársai: Br. J. Cancer, 42, 416 (1980); Ruff és munkatársai: J. Immunoi., 125, 1671 (1980); Mánnel és munkatársai: Infect. Immunty, 28, 204 (1980); Haranaka és munkatársai: Japan J. Exp. Med., 51, 191 (1981); továbbá a 90892 és 86475 közzétételi számú európai szabadalmi leírásban és a 21621/1983 közzétételi számú japán szabadalmi leírásban. A fenti irodalmi helyeken ismertetett leírások szerint a TNF-et nyúl, egér, hörcsög vagy tengerimalac szövetekből vagy test-folyadékokból - például vérből - állítják elő, tisztítással. A termékeket azonban nem definiálják pontosan, és nyilvánvalóan különböző korlátái is vannak ezeknek az eljárásoknak, a nyersanyagforrások és a végtermék tisztaságának tekintetében. Immunológiai szempontból klinikai alkalmazásra humán eredetű TNF lenne a legmegfelelőbb tumorellenes szer. A fenti ismert eljárásokat azonban nem lehet humán TNF előállítására alkalmazni. Humán eredetű tumorellenes hatású citotoxinként ismertek a humán perifériás monociták és humán mielocitás monocita leukémia sejtek által termelt citotoxinok [Matthews: Immunology, 44, 135 (1981)]; humán perifériás vérsejtekhez tartozó sejtek által termelt citotoxinok [Reed és munkatársai: J. Immunoi., 115, 395 (1975)]; és a humán B-sejt-vonalak által termelt citotoxinok [Williamson és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 80, 5397 (1983)]. A fenti anyagok citotoxikus aktivitással rendelkeznek, de nincsenek világosan definiálva ezek sem. A találmány szerinti, rekombináns DNS technológián alapuló eljárással sikerült a humán TNF polipeptidet kódoló cDNS-t klónozni. A kutatások során azt is kimutattuk, hogy a humán TNF cDNS kódolja a prekurzor polipeptidet is. A találmány szerinti eljárással sikerült továbbá egy gazdaszervezetbe bevitt, klónozott humán TNF cDNS-t tartalmazó expressziós vektor segítségével a gazdaszervezetben humán TNF polipeptidet előállítani, és azt a homogenitás eléréséig tisztítani. A leírásban az egyszerűség kedvéért az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk. A adenin C citozin G guanin T timin Alá alanin Arg arginin Asn aszparagin Asp aszparaginsav Cys cisztein Gin glutamin Glu glutaminsav Gly glicin His hisztidin Ile izoleucin Leu leucin Lys lizin Met metionin Phe fenilalanin Pro prolin Ser szerin Thr treonin Trp triptofán Tyr tirozin Val valin DNS dezoxiribonukleinsav cDNS komlementer DNS sscDNS egyszálú cDNS dscDNS kettős szálú DNS RNS ribonukleinsav mRNS messenger-RNS poli(A)mRNS poli(A)-t tartalmazó mRNS dATP dezoxiadenozin-trifoszfát dCTP dezoxieitidin-trifoszfát dGTP dezoxiguanozin-trifoszfát dTTP dezoxitimidin-trifoszfát oligo(dC) oligodezoxieitidinsav oligo(dG) oligodezoxiguanilsav oligo(dT) oligodezoxitimidilsav 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
