202920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén rekombináns immun interferon fragmensek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 920 B 2 sen felhasználható, a rekombináns immun interferon fragmenst kódoló és a kifejező kontroll szekvenciához működőképesen kapcsolt replikálható expressziós vektorok az alábbiak pIFN-y(-6), pIFN- y(-7), pIFN-y(-8), pIFN-yC- 9), pIFN-y(-10) és pIFN-Y(-ll), ahol is a rekombináns immun interferon fragmenseket kódoló szekvenciák a pDS8/RBSII,SphI expressziós vektorba vannak beillesztve (2. ábra). A pDS8/RSBII,SphI-t a pDMT.l plazmiddal transzformált (4. ábra) E.coli M15 (pDMI,l) törzsbe, egy E.coli törzsbe (E.coli DZ291) illesztjük be; ez a plazmid kódolja a lac represszort. A keletkező E.coli M15 (pDS8/RBSII,SphI; pDMI,l) törzset 1986. augusztus 6-án helyeztük letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) intézménynél; a törzs deponálási száma DSM 3809 és ezen a számon vált hozzáférhetővé. Az IFN-y(- 6), pIFN- y(-7), IFN-y(-8), IFN- y(-9), IFN-tf-lO) és IFN-y(- 11) rekombináns immun interferon fragmenseket kódoló expressziós hordozók felépítésének módszereit a példákban részletesen ismertetjük. A példák alapján a találmányunk szerinti rekombináns immun interferon fragmensek kifejezésére képes expressziós hordozók felépítése a szakember kötelező tudásához tartozik. A rekombináns immun interferon fragmensek kifejezésére képes replikálható expressziós hordozókat ezután a példákban vagy Maniatis és tsai fent idézett közleményében leírt specifikus eljárásokkal megfeleő gazdaszervezetekbe transzformáljuk. A felhasznált gazdasejttől függően a rekombináns immun interferon fragmensek glikozilált vagy glikozilálatlan formában lehetnek. Gazdaszervezetként előnyösen Escherichia coli [pl. M15 törzs vagy W3110 törzs (ATCC No. 27 325)] vagy Bacillus subtilis törzseket stb. alkalmazhatunk. Találmányunk céljaira legelőnyösebb gazdaszervezetnek a fent említett E.coli M15 törzs bizonyult. Miután a találmányunk szerinti polipeptidek kifejezésére képes szervezeteket előállítottuk, a találmányunk szerinti eljárást a kifejező vektorok felépítésétől és a gazdaszervezet növekedési jellemzőitől függően többféleképpen végezhetjük el. A gazdaszervezetet általában nagymennyiségű sejt termelésének kedvező körülmények között tenyésztjük. Nagymennyiségű sejt felhalmozódása után a táptalajban megfelelő inducer vagy derepresszor vagy a hőmérséklet eltolódása a DNS-szekvenciával ellátott kontrollszekvenciát aktiválja és ez lehetővé teszi a kódoló szekvencia transzkripcióját (átírását) és transzlációját. A jelen találmány során a rekombináns immun interferon fragmenst kódoló gén kifejezését lac represszor gátolja. Nagyszámú sejt felhalmozódásakor az interferon gént izopropil-beta-D- tiogalaktopiranozid hozzáadásával derepresszáljuk (IPTG). A rekombináns sejt által termelt fehérjét a sejt önmagában ismert általánosan használatos módon történő lízisével felszabadítjuk. Az adott lizálási módszert a felhasznált gazdasejttől függően választjuk meg. A jelen találmány esetében a sejtek lizálását előnyösen guanidium-hidrokloriddal végezhetjük el. A találmányunk szerint előállított homogén rekombináns immun interferon fragmenseket bármely ismert módszerrel tisztíthatjuk, pl. ammónium-szulfátos lecsapással, a sók dialízis útján történő eltávolításával (normálnyomáson vagy vákuumban), gélszűréssel, kromatografálással, preparatív simaágyas izoelektromos fókuszálással, gélelektroforézissel, nagy teljesítőképességű folyadékkromatografálással (HPLC), ioncserélő kromatografálással, gélszűréssel és fordított fázisú kromatografálással, affinitásos kromatografálással stb. vagy monoklónális vagy poliklónális antitestek felhasználásával. A kapott homogén rekombináns immun interferon fragmensek SDS-poliakrilamid gélelektroforézis vagy HPLC-analízis szerint más fehérjéktől gyakorlatilag mentesek. A rekombináns immun interferon fragmensek dimereket, trimereket vagy tetramereket képezhetnek és ez azt jelenti, hogy a tisztított rekombináns immun interferon fragmensek két, három vagy négy ilyen fragmens kombinációjaként lehetnek jelen. Az összekapcsolódási mechanizmus jellege nem tisztázott. Az IFN-y(-6), IFN-y(-7), IFN-y(-8), IFN-y(-9), IFN- y(-10) és IFN-y(-ll) rekombináns immun interferon fragmensek vírusellenes aktivitását a citopatikus hatás csökkenésén alapuló biomeghatározási módszerrel mérjük [lásd: Rubinstein et al.: J. Virol. 37, 755-758 (1981)]. Kihívó (challenge) vírusként humán amnion sejteket (FL-sejtek) és Sindbis vírust alkalmazunk. A mintákat előzetesen kb. 1000 egység/ml értékre hígítjuk és mikrotitráló lemezen titráljuk; a mérést kétszer végezzük el. Standardként teljes hosszúságú érett rekombináns immun interferon (a szekvenciát az 1. ábrán tüntetjük fel) készítményt alkalmazunk (charge szám 85.20 SX-Pool). Ezt az NIH referencia humán interferon gamma standardhoz (No. Gg 23-901-530) kalibráljuk. Az NIH standard titere 3,68 ± 0,34 logio egység/ampulla (n - 39). Az eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze. Minden érték legalább 13 különálló meghatározás átlagát képezi. A geometriai átlagtitereket a t-teszt segítségével statisztikusan értékeljük. Az érett rekombináns immun interferon és a rekombináns immun interferon fragmensek közötti eltérés nagymértékben szignifikáns (P - 99 %). Az IFN-yf-ó) és IFN-yf-ll) titerei közötti különbség ugyancsak nagymértékben szignifikáns. Az IFN-yf-ó) és IFN-y(-8) értékei szignifikánsan eltérnek (P - 95 %). Az IFN-y(-8) és IFN-yf-ll) hatáserőssége közötti eltérés azonban nem szignifikáns. 1. táblázat Fajlagos vírusellenes aktivitás Érett rekombináns immun interferon (rIFN-y) 9,5 • 106 U/mg Rekombináns immun interferon fragmens IFN-y(-6) 4,1 • 107 U/mg Rekombináns immun interferon fragmens IFN-y(-8) 5,9 • 107 U/mg Rekombináns immun interferon fragmens IFN-y(-ll) 7,0 • 107 U/mg 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
