202920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén rekombináns immun interferon fragmensek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 920 B 2 A fokozott vírusellenes aktivitás részletesebb vizsgálata céljából további rekombináns immun interferon ffagmenseket építünk fel a fentiekben leírtak szerint [pl. IFN-y(-4) és EFN-y(-5)] vagy teljes hosszúságú érett rekombináns immun interferon korlátozott proteolízisével [pl. IFN-y-(14)] egér szubmaxilláris mirigy „Arg C” proteáz felhasználásával állítunk elő; ez az enzim a fehérjét specifikusan az arginin karboxil-oldalán hasítja [Schenkein et al: Arch. Biochem. Biophys. 182, 64-70 (1977)]. Az IFN-y(-18)-t fibrinolitikus enzim plazmid felhasználásával állítjuk elő. A fenti polipeptidek specifikus vírusellenes aktivitását a korábbiakban leírtak szerint határozzuk meg. A 2. táblázat és a 12. ábra igazolja, hogy az IFN-yf-S), IFN-y(-9), IFN-y(-10) és EFN-yf-ll) rekombináns immun interferon fragmensek lényegesen erősebb fajlagos vírusellenes aktivitást mutatnak, mint az érett rekombináns immun interferon vagy a korlátozott proteolízissel előállított IFN-y(-14) és IFN-y(-18) immun interferon fragmensek. 2. táblázat Fajlagos vírusellenes aktivitás (egység/mg) (zárójelben a 95 %-os megbízhatósági határok) rIFN-y 1,91 • 107 (1,36 • 107-- 2,67 • 107) IFN-X-4) 2,88 • ío' (2,19 • 107 -- 3,80 • 10;) BFN-t(-5) 4,79 • 107 (3,54 • 107-- 6,47 • 107) IFN-y(-6) 3,39 • 107 (2,46 • 107 -- 4,66 • 107) IFN-y(-8) 7,08 • 10; (5,06 • 107-- 9,91 • 107) IFN-y(-9) 9,33 • 107 (6,60 • 107-- 1,32 • 108) IFN-y(-10) 8,32 • 107 (6,72 • 107-- 1,03 • 108) IFN-y(-ll) 6,31 • 107 (4,99 • 107 -- 7,97 • 107) Hasonlóképpen az DFN-7(-8), IFN-y(-9), IFN-y(-10) és IFN-y(-ll) immun interferon fragmensek számottevően erősebb sejtburjánzásgátló hatással és fokozott immunszabályozó aktivitással rendelkeznek. A sejtburjánzásgátló aktivitást oly módon határozzuk meg, hogy mérjük különböző immun interferonoknak a radioaktív jelzett timidinnek a sejt DNS-be történő beépülésére kifejtett gátló hatását. Három rosszindulatú sejtvonalat (U 937, BS 14, LLC 1) és egy normál fibroblaszt vonalat (AG, 1523, áthaladás no. 6-10) használunk. Az U-937 mielomonocitikus leukémiás sejtvonal; a BS 14 rosszindulatú melanomában szenvedő betegtől származik, míg a LLC 1-et tüdőrákos beteg szervezetéből nyertük. A sejteket 96 lyukkal ellátott mikrotiter lemezen szélesztjük 10 %-os magzati borjúszérummal, 1 % L-glutaminnal (200 mM), 1 % penicillinnel (100 egység/ml) - sztreptomicinnel (100 pg/ml), 1 % MÉM nem esszenciális aminosavakkal (100 x) és 1% nátrium-piruváttal (100 mM) kiegészített RPMI 1640 táptalajon, különböző sűrűségek mellett, az alábbi egyedi növekedési görbéknek megfelelően: U 937 és AG 1523 esetében 20 000 sejt/ml; BS 14 és LLC 1 esetében 1000 sejt/ml. A sejteket 24 órán át hagyjuk megkötődni. A mélyedésekbe érett rekombináns immun interferont (rlFN-y), illetve immun interferon ffagmenst [IFN-yi-lO)] adunk. A negatív kontroli-lemezeket önmagával a közeggel kezeljük, míg pozitív kontrollként adriamicint alkalmazunk 10 -lO^mól/1 koncentráció tartományban. Két nap múlva 3H-timidint adunk hozzá 1 pCi/mélyedés végső koncentrációban. A sejteket további 18 órás inkubálás után összegyűjtjük és a timidin beépülést Carr és tsai módszerével meghatározzuk [Cell. Immunoi. 5,21-29 (1972)]. Azt találtuk, hogy az AG 1523 sejtekkel szemben azonos sejtburjánzásgátló aktivitás kifejtéséhez 14-szer kisebb mennyiségű IFN- y(-l0) immun interferon ffagmens szükséges, mint érett rekombináns immun interferon (rlFN- y). Hasonlóképpen az U 937, BS 14 és LLC 1 sejtekkel szemben azonos sejtburjánzásgátló hatás az IFN-y(-10) felhasználásakor 5-ször, 3-szor, illetve 6-szor kevesebb anyaggal érhető el, mint az rlFN-y esetében. Ismertetés, hogy az immun interferon számos immunszabályozó funkciót közvetít, ezek egyike a makrofág-aktiváló faktor (MAF). A makrofág aktiválását két különböző úton mérjük. Talmadge és tsai [Eur. J. Immunoi. 16, 1471-1477 (1986)] módszerével kapott normál humán makrofágokat a jelen szabadalmi leírásban ismertetett immun interferon különböző formáival aktiválunk. Az oxidációs kitörést a peroxid-felszabadulás növekedésével mérjük, Pick és tsai módszerével [J. Immunol. Methods 46, 211-226 (1981)], míg a makrofágok baktericid-aktivitásának indukcióját "Peck és tsai módszerével határozzuk meg [J. Immunok Methods 82, 131-140 (1985)]. Minthogy az immun interferon immunszabályozó hatását a membránreceptorokhoz való kötődésen keresztül fejti ki, az immunszabályozó aktivitás függ az immun interferonnak a receptorjaihoz való kötődésétől. Radioaktív jelzett érett rekombináns immun interferonnak és rekombináns immun interferon fragmenseknek [Kung et al.: Meth. in Enzymology 119, 296-301 (1986)] az interferon receptorokhoz való kompetitiv kötődését Rashidbaigi és tsai módszerével mérjük [J. Bioi. Chem. 260, 8514— 8519 (1985)]. A kísérleti eredményeket a 13. ábrán foglaljuk össze. Az IFN-y(-8), IFN-y(-9), IFN- y(-10) és IFN-yf-ll) immun interferon fragmensek lényegében erősebb vírusellenes hatásuk mellett számottevő mértékben fokozott makrofág-aktivitást és receptorkötő képességet is mutatnak. w: A találmányunk szerint előállított új rekombináns immun interferon ffagmenseket szobahőmérsékleten több napon át állni hagyjuk. A HPLC-analízisben nem keletkeznek új csúcsok, mint azt a teljes hosszúságú érett rekombináns immun interferon esetében megfigyeltük. így tehát a találmányunk szerinti új rekombináns immun interferon fragmensek fokozott aktivitásuk mellett stabilabbak a teljes hosszúságú érett rekombináns immun interferonnál. A találmányunk szerint előállított, tisztított rekombináns immun interferon ffagmenseket vagy keverékeit gyógyászati készítmények előállítására használhatjuk. Ezek a gyógyászati készítmények lényegileg azonos vírusellenes aktivitás kifejtéséhez lényegesen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
