202920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén rekombináns immun interferon fragmensek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 920 B 2 hasonlóképpen építjük fel, Hinfl-HindlH adapterek felhasználásával. A(-7) AGTCAGATGCTGTTTTAA GTCTACGACAAAATTTCGA A(-9) AGTCAGATGIAA GTCTACATTTCGA A(-10) AGTCAG3AA GTCATTTCGA A szekvenciában a transzlációs végződések releváns kódonjait aláhúztuk. 9. ábra F(-6), F(-8) és F(-ll) ffagmenseknek a pDS8/RBSII, Sphl EcoRI- és Hindül-hasítási helyeibe történő, a pIFN-y(-6), pIFN-y(-8) és pIFN-y(-ll) plazmidokat eredményező beillesztésének sematikus ábrázolása. A F(-7), F(-9) és F(-10) ffagmenseket hasonlóképpen beillesztve a pIFN-y(-7), pIFN-y(-9) ás pIFN-y(-10) plazmidokat kapjuk. 10. ábra ArIFN-y, IFN-y(-6), EFN-t(-7), IFN-y(-8), IFN-y(-9), IFN-y(-10) és IFN-yC-ll) kifejezésével előállított pGLS, PIFN-y(-6), pIFN-y(-7), pIFN-y(-8), pIFN-y(-9), pIFN-y(-10), illetve pIFN-y(-ll) géntermékek aminosav-szekvenciái. A (130aa) jelölés az 1-helyzettől a 130-helyzetig elhelyezkedő 130 aminosavat jelenti (lásd 1. ábra). 11. ábra Érett humán immun interferon és humán interferon fragmensek SDS-poliakrilamid gélelektroforézisének analízise. A a, b, c és d pályán (11a. ábra, A rész) és az 1-9. pályán (1 lb. ábra) a pDMI,l-et befogadó E.coli M15 sejtek lizátumait és ezenkívül az alábbiakban megjelölt kifejezési vektort mutatjuk be: Kifejezési vektor 11a. ábra pálya 11b. ábra pálya pGLS a pIFN-y(-4) 1,9 2 PIFN--K-5)-3 pIFN-y(-6) b 4 plFN-y(-8) c 5 pIFN-Y(-9)-6 pIFN-yf-lO)-7 pIFN-'jf-ll) d 8 Az a, b, c és d pályán (11a. ábra B-rész) és a 10-17., valamint 20. pályán (11b. ábra) az a, b, c és d (11a. ábra, A rész) és az 1-9. pálya (11b. ábra) lizátumairól izolált tisztított interferon polipeptideket mutatjuk be. A korlátozott proteolízissel előállított IFN-y(-14) és IFN-y(-18) humán immun interferon ffagmenseket a 18. illetve 19. pályán mutatjuk be. MW (11a. ábra) és M (11b. ábra) protein nagyság markert jelöl (BIO-RAD Laboratories), amely 14,4 kD, 21,5 kD, 31 kD, 45 kD, 66,2 kD és 92,5 kD mokekulatömegű fehérjékből áll (1 kD - 1000 dalion). 12. ábra A IFN-y karboxiterminális szekvenciájához viszonyított vírusellenes aktivitás. A karboxiterminális szekvenciát az abszcisszán Dayhoff és tsai által leírt egybe tűs kóddal adjuk meg [„Atlas of Protein Sequence and Structure”, M.O. Dayhoff, ed., Vol. 5, p. 17, Natl. Biomed. Res. Found., Silver Spring, Maryland, USA, (1979)]. A rekombináns immun interferon fragmenst az abszcisszán oly módon azonosítjuk, hogy megadjuk a teljes hosszúságú érett rekombináns humán immun interferonhoz ( azonosítási jele „O”) viszonyítva törölt aminosavak számát. Az ily módon az abszcisszán jelölt rekombináns immun interferon fragmensek vírusellenes aktivitását az ordinátán ábrázoljuk. Minden pont legalább 6 független meghatározás geometriai átlagos titerét jelenti. A függőleges vonalak a megfelelő 95 %-os megbízhatósági határokat jelentik. 13. ábra Vírusellenes aktivitás, makrofág-aktivitás és receptorkötőképesség összehasonlítása, az IFN-y karboxiterminális szekvenciájához viszonyítva (a részletekkel kapcsolatban a 12. ábra jelölésére és a megfelelő szövetrészre hivatkozunk). Az immun interferon fragmensek vírusellens aktivitását, makrofág-aktivitását és receptoikötő képességét az érett rekombináns immun interferon megfelelő értékeihez viszonyítva (utóbbiakat önkényesen 1-nek tekintjük) logaritmikus skálán tüntetjük fel. Az érett rekombináns immun interferon makrofág-aktivitásának abszolút értéke 5 • 105 egység/mg. Találmányunk előnyös foganatosítási módja szerint^ a rekombináns immun interferon ffagmenseket a humán immun interferon gén teljes hosszúságú kópiáját vagy allelikus variánsait tartalmazó megfelelő plazmid kiválasztásával állíthatjuk elő. A transzlációs stop kodonokat ezután az immun interferon C-terminálisát kódoló gén tartományába helyről irányított mutagénízissel [lásd: Smith et al. „Genetic Engineering” 3, 1- 32 (1981); J.K. Setlow, A. Hollaender eds., Plenum Press, New York] illeszthetjük be vagy oly módon, hogy ebből a tartományból a megfelelő restrikciós fragmenst eltávolítjuk és ezt a restrikciós fragmenst a rekombináns immun interferon ffagmens kívánt C-terminálisát kódoló szintetikus DNS-fragmenssel helyettesítjük. Az utóbbi módszer során a kiindulási plazmid felvágására előnyösen két különböző restrikciós endonukleázt alkalmazunk, két különböző ragadós véget létrehozva. A kiegészítő ragadós végeket tartalmazó szintetikus DNS-t közvetlenül a helyes orientációban illeszthetjük be. A következő lépésben a rekombináns immun interferon fragmenst kódoló DNS szekvenciát replikálható mikrobás expressziós hordozóba illesztjük be, amely a replikádé eredetét, promotort vagy promotor-operátort és riboszómás kötődési helyet (RBS) kódoló szekvenciát tartalmaz. Megfelelő kifejezési hordozók Maniatis és tsai fent említett közleményében vagy a jelen szabadalom példáiban találhatók. Előnyö-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
