202920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén rekombináns immun interferon fragmensek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 920 B 2 vei [Nature 227, 680-685 (1970)] elektroforézisnek vetjük alá. A fehérjéket Coomassie brilliant Blue R- 250 színezékkel megfestjük, majd a meg nem kötött színezéket a gélről eltávolítjuk. A gél azt mutatja, hogy az IFN-y(-6), IFN-y(-7), IFN- y(-8), IFN-y(-9), IFN-y (-10) és IFN-y(-ll) rekombináns immun interferon ffagmensek az E.coli-ban nagyobb mennyiségben termelődnek, mint a teljes hosszúságú rekombináns érett immun interferon annak ellenére, hogy az összes fehérje ugyanazon kifejezési kontroll szekvencia ellenőrzése alatt van. 5. példa Rekombináns immun interferon fragmensek tisztítása Az összes rekombináns humán immun interferon fragmenst az alábbi módszerrel tisztítjuk homogenitásig: A rekombináns immun interferon ffagmens kifejező vektorát tartalmazó rekombináns E.coli sejteket a fentiekben leírt módon tenyésztünk. Az IPTG-vel végzett indukció és további 6 órás inkubálás után a sejteket centrifugáljuk (4000 g, 10 perc, 4 'C). A felül elhelyezkedő folyadékot elöntjük. A sejtek feltárását (100g) 7 mólos guanidin-hidrokloriddal 0,01 mólos nátrium-borát pufferben (pH 8,0) végezzük (300 ml). A kapott szuszpenziót egy órán át 4 °C-on keverjük. A szolubilizált rekombináns immun interferon fragmenst az oldhatatlan részektől centrifugálással (10 000 g, 30 perc, 4'C) választjuk el. A felül elhelyezkedő folyadékot 10-szeres térfogatú 0,15 mólos nátrium-borát-oldattal (pH 8,0) hígítjuk és a visszamaradó részecskéket a korábbiakban leírt módon centrifugálással választjuk le. A nyers extraktumhoz 360 g szilikagél 100-t adunk (részecskenagyság 0,063-0,200 mm). A szuszpenziót a szedimentálódás elkerülése céljából óvatosan keverjük. A keverést egy óra múlva leállítjuk. Az üledék kialakulása után a felül elhelyezkedő folyadékot elöntjük és az üledéket oszlopra visszük (átmérő 5 cm, hosszúság 17,5 cm). Az oszlopon levő szilikagélt 1 mólos nátrium-kloriddal 0,01 mólos nátrium-borátban (pH 8,0) mossuk (átfolyási sebesség 6 ml/perc). A rekombináns immun interferon fragmenst 0,5 mólos tetrametil-ammőniumkloriddal és 0,7 mólos ammónium-szulfáttal 0,01 mólos nátrium-borát pufferben (pH 8,0) eluáljuk (átfolyási sebesség 6 ml/perc). Az eluátumot azonnal gyors átáramlású fenil-Sepharose oszlopra szivattyúzzuk (átmérő 5 cm, hosszúság 21 cm, Pharmacia, Prototyp gel KK33904, amelyet előzetesen 0,5 mólos tetrametil-ammónium-kloriddal és 0,7 mólos ammónium-szulfáttal 0,01 mólos nátrium-borát pufferben (pH 8,0) egyensúlyba hoztunk (átfolyási sebesség 6 ml/perc). A rekombináns immun interferon fragmens az átáramló folyadékban helyezkedik el, míg a szennyező proteázok a mátrixon megkötődnek. Az oszlopot 0,01 mólos nátrium-borát pufferrel (pH 8) történő mosással regeneráljuk. Következő lépésben a fenil-Sepharose oszlopról eluált rekombináns immun interferon fragmenst fenil-Sepharose CD-4B oszlopon (átmérő 5 cm, hosszúság 21 cm, Pharmacia) adszorbeáltatjuk; ezt az oszlopot 0,7mólos ammónium-szulfáttal 0,01 mólos nátrium-borát pufferben (pH 8,0) egyensúlyba hozzuk. Az oszlopot extenzíven mossuk és a rekombináns immun interferon fragmenst 0,01 mólos nátrium-borát pufferrel (pH 8,0) szemben 4 órás lineáris gradiens szerint eluáljuk. Az eluátumot 4-szeres térfogatú vízzel hígítjuk és Fractogel TSK CM-650 (M) oszlopra (átmérő 2,6 cm, hosszúság 18 cm; Merck) visszük fel; az oszlopot előzetesen pirogén anyagoktól mentes 0,05 mólos nátrium-foszfát pufferrel (pH 6,0) egyensúlyoztuk ki (átfolyási sebesség 4 ml/perc). A rekombináns immun interferon fragmenst 0-0,6 mólos nátrium-kloriddal lineáris nátrium-klorid gradiens szerint eluáljuk. Végső tisztítási lépésben a rekombináns immun interferon fragmens frakciót szuperfinomságú Sephadex G-50 oszlopra (átmérő 5 cm, hosszúság 85 cm; Pharmacia) visszük fel; az oszlopot előzetesen 0,05 mólos pirogén anyagoktól mentes nátrium-foszfát pufferrel hoztuk egyensúlyba (pH 7,5). Az átfolyási sebességet 2ml/perc értékre állítjuk be. A fenti módon tisztított rekombináns immun interferon fragmensek RP-18 HPLC-analízis és SDS-poliakrilamid gél elektroforézis tanúsága szerint homogének. A C-terminális aminosav-analízis elvégzése céljából a tisztított fehérjéket Staphylococcus aureus V8 proteáz segítségével emésztjük. A C-terminális peptideket RP- 18 HPLC segítségével izoláljuk, liofílizáljuk, sósavval hidrolizáljuk és aminosav-analízisnek vetjük alá. A hidrolizátum a várt aminosavakat tartalmazza. A rekombináns immun interferon fragmens steril szűrés után 4 “C-on több hónapon át végzett tárolás után stabilnak bizonyult. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás valamely X-Y-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-iyr-Phe-Asn-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala-Asp-Asn-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-Gly-Ile-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-Glu-Glu-Ser-Asp-Arg-Lys-He-Met-Gln-Ser-Gln-Ile-Val-Ser-Phe-Tyr-Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Asn-Phe-Lys-Asp-Asp-Gln-Ser-Ile-Gln-Lys-Ser-Val-Glu-Thr-Ile-Lys-Glu-Asp-Met-Asn-Val-Lys-Phe-Phe-Asn-Ser-Asn-Lys-Lys-Lys-Arg-Asp-Asp-Phe-Glu-Lys-Leu-Thr-Asn-Tyr-Ser-Val-Thr-Asp-Leu-Asn-Val-Gln-Arg-Lys-Ala-De-His-Glu-Leu-Ile-Gln-Val-Met-Ala-Glu-Leu-Ser-Pro-Ala-Ala-Lys-Thr-Gly-Lys-Arg-Lys-Aig-Z (mely képletben X jelentése metionin és Y jelentése glutamin maradék vagy X jelentése hidrogénatom és Y jelentése glutamin vagy piroglutamin maradék és Z jelentése Ser, Ser-Gin, Ser-Gln-Met, Ser-Gln-Met-Leu, Ser-Gln-Met-Leu-Phe vagy Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Aig) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
