202920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén rekombináns immun interferon fragmensek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 920 B 2 Találmányunk homogén rekombináns humán interferon fragmensek előállítására vonatkozik, amelyekben a teljes hosszúságú érett rekombináns humán immun interferonnal (ennek aminosav-szekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be) összehasonlítva a karboxil-végcsoporton 6-11 aminosav törölve van. Találmányunk tárgya továbbá eljárás a fent meghatározott rekombináns immun interferon fragmenst kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó replikálható mikrobás expressziós hordozók előállítására. Találmányunk ezenkívül a fenti expressziós hordozókkal transzformált mikroorganizmusok, valamint a fenti interferon fragmensek előállítási eljárására vonatkozik. Találmányunk tárgya továbbá egy vagy több fenti rekombináns immun interferon fragmenst tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására. A fenti rekombináns immun interferon fragmenseket tartalmazó gyógyászati készítmények különböző betegségek és beteg állapotok kezelésére alkalmazhatók. A természetes humán immun interferon (IFNy) limfociták mitogén stimulálása útján keletkezik. A természetes humán immun interferon vírusellenes és sejtburjánzásgátló hatást fejt ki, amely pH 2 labilis. Az immun interferon funkcionális formája multimer lehet, leggyakrabban dimer, trimer vagy tetramer [Pestka et al„ J. Bioi. Chem. 258, 9706-9709 (1983)]. Azt találtuk, hogy az immun interferont a humán genomba egyetlen gén kódolja, amely 166 aminosavból álló prekurzor-polipeptidet kódol [Dérynék et al., Nucleic Acids Res. 10, 3605-3615 (1982)]. Feltételezések szerint a poszt-transzlációs eljárás 146 aminosavat tartalmazó és Cys-Tyr-Cys-Gln-... N-terminális szekvenciát magában foglaló polipeptidet eredményez. Rekombináns DNS technológiák alkalmazásával [lásd pl. Maniatis et al.: „Molecular cloning - A laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] a fenti 146 aminosavat tartalmazó rekombináns immun interferont kódoló kifejező vektorokat építettek fel. A fenti kifejező vektorokat mikrobás gazdaszervezetbe bevíve 147 aminosavból (nevezetesen a fent említett 146 aminosavból és további N-terminális metioninból) álló rekombináns immun interferon polipeptideket szintetizáltak. A további metionin a metionin-aminosavat kódoló mRNS transzlációs start szignál AUG-ból származik. E transzlációs start szignál a szülő humán génben a szignál peptid előtt helyezkedik el. A poszt-transzlációs eljárás során ez a szignál peptid a transzlációs start szignálból származó metioninnal együtt lehasad és ez 146 aminosavból álló, metionin-mentes érett immun interferonhoz vezet. Prokariota gazdaszervezetek nem képesek lehasítani a szignál pepiidet a humán immun interferon prekurzor polipeptid előtt a megfelelő helyzetben. Ezért a szignál peptidet kódoló szekvenciát az immun interferon génben génsebészeti úton el kell távolítani az immun interferon érett formában történő kifejezése céljából. Az érett polipeptidet kódoló szekvencia előtt közvetlenül levő ATG kodon a rekombináns humán immun interferonban jelenelevő N-terminális metionint eredményez. Annak ellenére, hogy további N-terminális metionin van jelen és ez nincs glikozilálva, a rekombináns immun interferon a humán limfocitákból izolált immun interferon aktivitásával összehasonlítható vírusellenes és sejtburjánzásgátló hatással rendelkezik, amely pH 2 labilitással párosul [Gray et al. Nature 295, 503-508 (1982)]. Később Rinderknech és tsai kimutatták [J. Bioi. Chem. 259, 6790-6797 (1984)], hogy indukált humán perifériás vér limfocitákból tisztított immun interferon 143 aminosavat tartalmazó, Cys-Tyr- Cys-szekvencia hiányos és N-végcsoportján piroglutamát-maradékot tartalmazó polipeptidből áll. Bizonyos heterogenitást a karboxil-végcsoporton is megfigyeltek. Az eredeti rekombináns immun interferon gén génsebészeti úton történő ismételt kialakítása a fenti 143 aminosavat és az N-végcsoporton további metionint tartalmazó érett rekombináns immun interferont kódoló kifejezési vektorokhoz vezet. A Cys-Tyr- Cys-szekvenciát magában foglaló, illetve azt nem tartalmazó rekombináns humán immun interferonok biológiai aktivitásának összehasonlítása azt mutatja, hogy a Cys-Tyr-Cys-szekvencia törlése kétszer erősebb vírusellenes aktivitást idéz elő (146 354 sz. európai szabadalmi bejelentés; kinyomtatva 1985. június 26-án). A 146 354 sz. európai szabadalmi bejelentés további kitanítása szerint érett rekombináns humán immun interferon korlátozott triptikus emésztésével kialakított immun interferon fragmensek gyengébb vírusellenes hatást mutatnak, mint a 139 vagy 143 aminosavat 98 : 2 arányban tartalmazó interferon polipeptid keverékből (referens anyag) álló rekombináns immun interferon készítmények. így pl. a 131 aminosavból álló, 12 C-terminális aminosavat nem tartalmazó fragmens a fenti referens anyaghoz viszonyítva 40-50 %os fajlagos aktivitást mutat. A C-végcsoportról további 3 vagy 6 aminosav eltávolításával kialakított fragmensek fajlagos aktivitása a referens anyagénak 6-9, illetve 1 %-a. A fent említett európai szabadalmi bejelentésben példaszerűen bemutatott immun interferon fragmensek csökkent aktivitásából az a következtetés vonható le, hogy terminális aminosavakat nem tartalmazó valamennyi fragmens gyengébb vírusellenes hatással rendelkezik, mint a fent említett referens anyag vagy a 143 aminosavból álló, az N-végcsoporton Cys- Tyr-Cys-szekvenciát nem tartalmazó érett rekombináns humán immun interferon. Másrészről ezeket az immun interferon fragmenseket csak korlátozott triptikus emésztéssel állították elő. A tripszin katalizálja azon peptidkötések hidrolízisét, amelyek funkcionális karbonilcsoportja bázikus aminosavakból (általában argininból vagy lizinből) származik. Az immun interferon aminosav szekvenciája 20 lizin-maradékot és 8 aiginin-maradékot tartalmaz. A tripszin által kialakított egyes fragmensek mennyisége attól függ, hogy a fragmens képzéséhez lehasítandó peptidkötés milyen mértékben hozzáférhető. Mindemellett a korlátozott proteolitikus emésztés a fragmensek széles spektrumához vezet és a specifikus fragmensek homogenitásig történő tisztítása a kapott keverékből igen komoly problémákba ütközik, minthogy lényegében azonos aminosav-szekvenciával rendelkező és csupán néhány ami-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
