202920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén rekombináns immun interferon fragmensek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 920 B 2 nosav nagyságában különböző polipeptideket kell egymástól elválasztani. A 146 354 sz. európai szabadalmi bejelentésben ismertetett HPLC frakcionálás körülményei nem tekinthetők alkalmasnak immun interferon fragmensek homogenitásig történő tisztítására, azaz a fragmenseket nagyságban eltérő más immun interferon fragmensektől gyakrolatilag mentes formában kapják. Ezenkívül - a tripszin specifikus jellege következtében - a találmányunk szerinti, nem bázikus C-végállású aminosavakat (pl. szerint, glutamint, mitionint, leucint vagy fenil-alanint) tartalmazó immun interferon fragmensek triptikus emésztéssel nem alakíthatók ki. Feltételezhetően ezzel magyarázható, hogy a 146 354 sz. európai szabadalmi bejelentésben példaszerűen miért csupán 125, 129, 131 és 139 aminosavat tartalmazó, C-terminális aminosavként lizint vagy arginint magában foglaló immun interferon fragmenseket ismertetnek. Bár a fent említett európai szabadalmi bejelentésben immun interferon ffagmenseknek rekombináns DNS technológiával történő előállítására szolgáló módszert általánosan ismertetnek, az 1. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciában az első glutamin- maradéktól számított 132-137 aminosavat tartalmazó rekombináns humán immun interferon fragmenst homogén formában első ízben a jelen találmány tárgyát képező eljárásokkal állítottunk elő. Rendkívül meglepő módon azt találtuk, hogy a fenti homogén rekombináns immun fragmensek a teljes hosszúságú érett rekombináns immun interferonhoz viszonyítva fokozott fajlagos vírusellenes aktivitással rendelkeznek. Hasonlóképpen azt találtuk, hogy az immun interferon egyéb biológiai aktivitásai terén [összefoglaló mű: Trinchieri et al. Immunology Today 6, 131-136 (1985)] is a találmányunk szerinti rekombináns immun interferon fragmensek felülmúlják az érett rekombináns immun interferon hatását. Egy vagy több találmányunk szerinti rekombináns immun interferon fragmenst tartalmazó gyógyászati készítmények különböző fertőzéses állapotok kezelésére alkalmazhatók. Ezek közül pl. az alábbiakat említjük meg: vírusos fertőzések, neoplázisos fertőzések vagy reumatoid arthritis. A találmányunk szerinti homogén rekombináns immun interferon fragmensekben a teljes hosszúságú érett rekombináns humán immun interferonhoz viszonyítva a C-végcsoporton 6-11 aminosav törölve van. A találmányunk szerint előállított homogén rekombináns immun interferon fragmensek képlete közelebbről a következő: X-Y-Asp-Pro-iyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu- Lys-Lys-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala- Asp-Asn-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-Gly-Ile-Leu-Lys-Asn- Trp-Lys-Glu-Glu-Ser-Asp-Aig-Lys-Ile-Met-Gln-Ser- Gln-Ile-Val-Ser-Phe-Tyr-Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Asn- Phe-Lys-Asp-Asp-Gln-Ser-Ile-Gln-Lys-Ser-Val-Glu- Thr-Ile-Lys-Glu-Asp-Met-Asn-Val-Lys-Phe-Phe-Asn- Ser-Asn-Lys-Lys-Lys-Arg-Asp-Asp-Phe-Glu-Lys-Leu- Thr-Asn-Tyr-Ser-Val-Thr-Asp-Leu-Asn-Val-Gln-Arg- Lys-Ala-Ile-His-Glu-Leu-Ile-Gln-Val-Met-Ala-Glu- Leu-Ser-Pro-Ala-Ala-Lys-Thr-Gly-Lys-Arg-Lys-Aig-Z (mely képletben X jelentése metionin és Y jelentése glutamin-maradék vagy X jelentése hidrogénatom és Y jelentése glutaminvagy piroglutamát-maradék és Z jelentése Ser, Ser-Gin, Ser-Gln-Met, Ser-Gln-Met-Leu, Ser-Gln-Met-Leu-Phe vagy Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg). A találmányunk szerint előállított homogén rekombináns immun interferon fragmensek lényegesen erősebb biológiai hatással rendelkeznek, mint az érett rekombináns humán immun interferon, azaz a 143 aminosavból álló és az aminosav-szekvencia 1-helyzetében glutamin- vagy piroglutamát-maradékot tartalmazó teljes hosszúságú rekombináns immun interferon. Amennyiben az 1-helyzetben levő aminosav-maradék glutamin, úgy a teljes hosszúságú rekombináns immun interferon N-végcsoportján 144. aminosavként adott esetben további metionin-maradékot tartalmazhat. A további metionin-maradék a metionin-aminosavat kódoló mRNS transzlációs stárt szignál AUG-ből származik. Kifejezési rendszerekben (pl. E. coli) ez a metionin nem minden esetben mellőződik. Azt találtuk, hogy a további N-végállású inetionin nem biztosíthatja a legtöbb rekombináns poíipeptid biológiai aktivitását [Winnacken „Gene und Klone”, 255; oldal, VCH, Weinheim, NSZK (1985)]. A rekombináns immun interferonból vagy fragmenseiből az N-végállású metionin eltávolításával újonnan kialakított N-végállású glutamin-maradék piroglutamát-formává ciklizálódhat és ismereteink szerint ezíem csökkenti a biológiai aktivitást. A találmányunkizerinti rekombináns immun interferon fragmensek multimerizált formában - előnyösen dimer, trimer vagy tetramer alakjában - lehetnek jelen. A találmányunk szerint előállított rekombináns immun interferon fragmensek felhasználásával olyan gyógyászati készítmények állíthatók elő, amelyek lényegében azonos vírusellenes hatás kifejtéséhez lényegesen kevesebb rekombináns immun interferon fragmenst tartalmaznak, mint a hatóanyagként érett rekombináns humán immun interferon tartalmú gyógyászati készítmények. A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények a rekombináns immun interferon fragmensek mellett fiziológiailag kompatibilis hordozóanyagokat is tartalmaznak. A találmányunk szerint előállított gyógyászati készítmények különböző betegségek és betegségekkel összefüggő állapotok kezelésére alkalmazhatók. Megjegyezzük, hogy aminosav-helyettesítések (különösen a fent ismertetett rekombináns immun interferon fragmensek egyetlen aminosavának helyettesítései) lehetségesek, amelyek során érett rekombináns humán immun interferon fajlagos aktivitását felülmúló rekombináns immun interferon fragmensek variánsai jönnek létre. A rekombináns polipeptidek fenti helyettesítéseinek kialakítása a szakember kötelező tudásához tartozik. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
