202918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas ureáz előállítására
1 HU 202 918 B 2 1. táblázat Tisztítási lépések Összes fehérje Összes aktivitás (• 103 U) Fajlagos aktivitás (U/mg fehérje) Kitermelés (%) Sejtmentes kivonat 14,1 183,3 13,0 100,0 Etanol 5,2 157,6 30,3 86,0 Sephadex G-100 3,0 140,1 46,7 76,4 Sephadex G-200 1,0 78,7 78,7 42,9 DEAE-Sepharose CL-6B 0,37 60,7 164,0 33,1 Affinitás gél 0,10 35,4 354,0 19,3 Liofilizátum 0,10 35,0 336,5 19,1 Szubsztrát 2. táblázat Fajlagos aktivitás (%) (6) Molekulatömege Sephadex G-200-as gélszűréssel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 220 000 dalton. Karbamid 100,0 Allantoin 1,2 Allantoinsav 8,8 Biurét 64,1 Metil-karbamid 4,9 Etil-karbamid 41,1 (7) Izoelektromos pont Poliakrilamid gélen történő izoelektromos fókuszálással meghatározva az enzim izoelektromos pontja 4,7. (8) Kristályszerkezet Ezt az enzimet nehezen lehet kristályosítani. (3) pH-optimuma és pH-stabilitása Amint az az 1. ábrán látható, az enzim pH-optimuma 2 és 4,5 között található. A 2. ábrán a maradék aktivitás 30 látható, miután az enzimet 37 'C hőmérsékleten különböző pH-értékeknél 30 percig pihentetjük. Amint az a 2. ábrából látható, az enzim stabil 6 és 8 pH között, és elfogadható a stabilitása 2 és 10 pH között. (4) Hőmérséklet-optimuma és hőmérséklet-stabilitása Amint az a 3. ábrán látható, az enzim hőmérsékletoptimuma 60-70 °C. A 4. ábrán az enzim maradék aktivitása látható, miután pH - 4-nél és pH - 6-nál különböző hőmérsékleteken 30 percig pihentettük. Amint az a 4. ábrán látható, az enzim pH 6-os értéknél 60 °C-ig stabil és elfogadható a stabilitása pH - 4-nél is, egészen 60 “C-ig. (5) Inhibitorai Amint az a 3. táblázatból látható, az enzim inhibitorai a higany(II)-klorid, ezüst-nitrát, jód-ecetsav és acetohidroxámsav. 3. táblázat Inhibitor Koncentráció Fajlagos aktivitás (%) nélkül 100,0 AgNŰ3 0,05 mM 0,7 HgCl2 0,05 mM 0,6 jódecetsav 1,00 mM 15,4 Acetohidroxámsav 10,00 mM 10,0 (9) Elemanalízis Nem végeztük el a kristályosítási nehézségek miatt. (10) Km Az enzim Km-értéke 1,7 mól (pH - 4-nél, 0,1 mólos citrátpufferral). 35 2. példa Az 1. példában ismertetett módon, de Lactobacillus fermentum JCM 5867-ből (IFO 14 511, FERM BP- 1454) készített oltótenyészetet oltunk 10, 2 literes Erlenmeyer-lombikba, amely 1 liter következő összeté- 40 telő sterilizált tápközeget tartalmaz: 4 % glükóz, 1,5 % polipepton, 1 % húskivonat, 0,8 % élesztőkivonat, 0,5 % nátrium-klorid, 0,2 % vízmentes nátrium-acetát, 0,5 % karbamid, 0,05 % mangán-szulfát (mintegy 4 H2O), 0,002 % nikkel-szulfát (6 H2O), 0,002 kobalt- 45 szulfát (7 H2O), 0,005 % ón(II)-szulfát és 0,001 % stroncium-szulfát (pH - 7,0, amelyet 30 % NaOH-val állítunk be) és stacionárius tenyésztést végzünk 32 "C hőmérsékleten 2 napon keresztül. Az eljárással 10 liter baktériumtenyészetet tartalmazó folyadékot kapunk, 50 amelynek savas ureáz aktivitása 5,6 U/ml. A sejteket a fenti folyadék centrifugálásával gyűjtjük össze, majd 0,05 M foszfátpufferral kétszer mossuk (pH - 7,2), és 4 liter 0,05 M foszfátpuffert (pH - 7,2), 1 M EDTA-t és 1 M ditio-treitolt tartalmazó 55 oldatban szuszpendáljuk. Ekkor hozzáadunk 2 liter 0,1 és 0,2 mm közötti átmérőjű üveggyöngyöt, majd a sejtszuszpenziót mechanikusan szétbontjuk 4500 ford/percnél 20 percig végzett kezeléssel. A szétbontott sejtszuszpenziót centrifugáljuk, majd a felülúszó- 60 hoz etanolt adagolunk 80 %-os végkoncentrációnál. 9
