202918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas ureáz előállítására
1 HU 202 918 B 2 Az üledéket centrifugálással választjuk el, és 1 M EDTA-t és 2-merkapto-etanolt tartalmazó 0,05 M trisz- HCl-pufferban (pH - 7,0) oldjuk. Az oldatot Sephadex G-100-as adszorpciós oszlopra visszük (7,5 cm átmérőjű és 90 cm hosszú). Az eluálást ugyanezzel a pufferral végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük és Sephadex G-200-as adszorpciós oszlopra visszük (4,5 cm átmérőjű és 150 cm hosszú). Az eluálást ugyanezzel a pufferral végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük, és ezután DEAE-Sephadex A-50-es, ugyanezzel a pufferral kiegyensúlyozott oszlopra visszük, gradiens eluálást végzünk ugyanezzel a pufferral, amely 0-0,7 M nátrium-kloridot is tartalmaz. Az aktív frakciókat egyesítjük. Ennek az oldatnak a fajlagos aktivitása 35,2 U/mg fehérje, és az aktivitási kitermelés 43,7 %. A termék enzimkémiai tulajdonságait a következőkben mutatjuk be. B savas ureáz (1) Hatása Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel. (2) Szubsztrátspecifítása Az enzim főként a karbamidra hat, valamint bizonyos mértékben az etil-karbamidra, biurétra, metil-karbamidra és allantoinsavra (lásd a 4. táblázatot). 4. táblázat Szubsztrát Relatív aktivitás (%) Karbamid 100,0 Allantoin 0,0 Allantoinsav 3,7 Biurét 72,0 Metil-karbamid 14,0 Etil-karbamid 46,0 (3) pH-optimum és pH-stabilitás Amint azt az 5. ábra mutatja, a pH-optimum pH - 3 körül található. A 6. ábra mutatja a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 °C-on különböző pH-értékeknél 30 percig pihentettük. Amint az a 6. ábrán látható, az enzim 6 és 8 pH között stabil. (4) Hőmérséklet-optimuma és hőmérséklet-stabilitása Amint a 7. ábra mutatja, ennek az enzimnek a hőmérséklet-optimuma 60-70 'C között található. A 8. ábra tünteti fel a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 4-nél és pH - 6-nál 30 percig pihentettük. Amint az a 8. ábrán látható, az enzim pH - 6-nál 80 'C-ig, pH - 4-nél 60 °C-ig stabil. (5) Inhibitorai Amint az 5. táblázatban látható, az enzimet a higany (Il)-klorid, az ezüst-nitrát, a réz-szulfát, a jódecetsav és az acetohidroxámsav gátolja. 5. táblázat Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%) nélkül 100,0 AgN03 0,05 mM 0,4 CuS04 5H20 0,40 mM 47,6 HgCl2 0,005 mM 0,8 jódecetsav 1,00 mM 14,9 acetohidroxámsav 10,00 mM 16,0 (6) Molekulatömeg Sephadex G-200-as gélszűréssel meghatározva ennek az enzimnek a mokekulatömege mintegy 210 000 és 220 000 dalton között található. (7) Izoelektromos pont Poliakrilamid gélen történő izoelektromos fókuszálással meghatározva az enzim izoelektromos pontja 4,8. (8) Kristályszerkezet Az enzimet nehezen lehet kristályosítani. (9) Elemanalízis Nem végeztük a kristályosítási nehézségek miatt. (10) Km Az enzim Km-értéke 1,0 mM (pH - 2-nél 0,1 M citrátpufferral). 3. példa Kereskedelmi forgalomban kapható GAM félfluid tápközegen tenyésztett (a tápközeg a Nissui Seiyaku cég terméke) Streptococcus bovis PG-186-ot (IFO 14 634, FERM BP-1449) 10, 200 ml-es Erlenmeyer-lombikba oltunk, amely egyenként 50 ml következő összetételű sterililzált oltótápközeget tartalmaz: 4 % glükóz, 1,5 % polipepton, 1 % húskivonat, 0,8 % élesztőkivonat, 0,5 % nátrium-klorid, 0,2 % vízmentes nátrium-acetát, 0,5 karbamid, 0,005 % mangán-szulfát (mintegy 4 H2O) és 0,001 % nikkel- szulfát (6 H2O) (pH - 7,0, 30 %-os NaOH-val semlegesítve). A lombikokat álló kultúrában 34 °C hőmérsékleten 24 órán keresztül inkubáljuk. Az így elkészített oltótenyészetet 10 db 2 literes Erlenmeyer lombikba töltjük, amely egyenként 1 liter azonos összetételű sterilizált tápközeget tartalmaz és az inkubálást álló körülmények között 32 °C hőmérsékleten 2 napig végezzük. Az eljárással 10 liter baktériumtenyésztő folyadékot kapunk, melynek savas ureáz aktivitása 7,6 U/ml. A fend tenyészetet centrifugáljuk, így nyerjük ki a sejteket, amelyeket azután kétszer 0,05 M foszfátpufferral (pH - 7,2) mosunk, majd 4 liter 0,05 M foszfátpuffert (pH - 7,2) 1 mM EDTA-t és 1 mM ditiotreitolt tartalmazó oldatban szuszpendálunk. Ekkor hozzáadunk 2 liter 0,1 és 0,2 mm közötti átmérőjű 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
