202917. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gamma-glutamil-transzpeptidáz előállítására
1 HU 202 917 B 2 immobilizált formában. Egész sejtek immobilizálására alkalmas anyagok például kitozán, alginát, x-karrageenan, poliakrilhidrazid, valamint az irodalomból ismert eljárásokban szokás szerint alkalmazott egyéb anyagok (K. Venkatsubramanian, Immob. Cells (1979), ACS Symposium Sereis, 106. old.). A hidrolizálást legelőnyösebben 6,6 és 8 közötti pH- érték mellett, mintegy 28-38 °C-on végezzük. Előnyösen olyan (I) általános képletű vegyületet alkalmazunk, amelyben R1 jelentése (a) képletű csoport, ahol R2 jeletnése hidrogénatom, hidroxilcsoport vagy metilkarbonilcsoport. A y-GTP gyakorlati jelentősége abban van, hogy vele C-cefalosporinból 7-amino-cefalosporánsavat lehet nyerni. Mind ez ideig úgy jártak el, hogy a C-cefalosporinból élesztő (Trigonospsis variábilis) segítségével glutaril-7-amino-cefalosporánsavat állítottak elő, amelyet egy második reakciólépésben enzimesen 7-aminocefalosporánsavvá kellett hidrolizálni. A találmány szerinti eljárással egyetlenegy lépésben nyerhetjük a 7-amino-cefalosporánsavat C-cefalosporinból. Az alábbi példákban a találmányt tovább részletezzük. A százalékok tömegszázalékok, ha mást nem kötünk ki. 1. példa A y-GTP-termelő B. subtilis IFO 3025, 3013 és 3335 mikroorganizmus előtenyészetét szetételű ferde agaron állítjuk elő: az alábbi öszglükóz 1% kazeipepton 0,4% húskivonat 0,4% élesztőkivonat 0,05% májkivonat 0,05% NaCl 0,25% pH 7,2 A ferde agaros csövecskéket 2 napon keresztül 28 'C-on inkubáljuk. Utána a sejteket 10 ml fiziológiás konyhasóoldattal lemossuk, és a kapott szuszpenzió 1 ml-ét használjuk fel 50 ml előtenyészet- közeg beoltására. Az előtenyészet-közeg 300 ml-es Erlenmeyer lombikban van, összetétele: pepton 1% malátakivonat 0,5% PH 7,0 A lombikot 190 perc'1 frekvenciával rázatva 30 'C- on 24 órán át inkubáljuk. A kapott tenyészet 2,5 ml-e 50 ml főtenyészet inokuluma. A főtenyészet tápközegének összetétele: pepton 0,12% élesztőkivonat 0,12% glükóz 0,25% Na-laktát (60%) 5,6 ml NH4C1 0,12% K2HPO4 0,12% KH2PO4 0,034% MgS04*7H20 0,025% NaCl 0,5% KC1 0,5% CaCl2*2H20 0,0015% MnCl2*4H20 0,0007% Fe(NH4)-citrát 0,00015%. A tenyészetet 24 órán át 28 'C-on, 190 perc'1 rázófrekvencia melett inkubálják, majd centrifugáljuk. Az alábbi táblázatban a fenti törzsek y-GTP-aktivitását adjuk meg. Törzs y-GTP (mE/ml tenyészlé) B. subtilis IFO 3025 60 B. subtilis IFO 3013 15 B. subtilis IFO 3335 25 2. példa Az 1. példában leírtak szerint előtenyészetet nevelünk B. subtilis IFO 3025 törzsből. E tenyészet 50 ml-ét az 5 literes fermentorban lévő 2 liter főtenyészet-közeg beoltására használjuk. A törzset 34 'C-on, 70% parciális 02-nyomás mellett tenyésztjük. A y- GTP képződését fotometriásan követjük, és a maximális enzimtiter elérése után a tenyészlét feldolgozzuk. A megadot feltételek mellett 150 mE/ml y- GTP- koncentrációt érünk el. 3. példa 9 liter tenyészlét cross-flow-szűréssel (300 000 dalton kizárási határ) szűrletre és sejtmasszára szétválasztunk. A szűrlet 1350 E y-GTP-aktivitást tartalmaz. Az enzimet ammónium-szulfát adagolásával kicsapjuk, majd az eredeti térfogat 1/10 részében újra oldatba visszük főtenyészet- közegben. Az oldatot 20 mM koncentrációjú, 8,0 pH-jú Trisz-puffen-el szemben dializáljuk, majd DEAE-cellulóz oszlopon (DE 52 Whatman továb tisztítjuk az enzimet. Az aktív frakciókat egyesítjük és betöményítjük. A kapott Qg-GTP- készítmény (mintegy 25 E y-GTP/ml aktivitása van) a kívánt reakcióhoz már felhasználható. 4. példa Dezacetil-CPC (dezacetil-cefalosporin C) preparatív átalakítása céljából az alábbi elegyet készítjük; 100 pl enzim-koncentrátum (a 3. példa szerinti) 100 pl 40 mM dezacetil-CPC (20 mM koncentrációjú, 7,3 pH-jú kálium-foszfát-pufferben oldva). Az elegyet 33 'C-on inkubáljuk. A fenti körülmények között maximum 16% dezacetil-7-amino-cafalosporánsav képződik. 5. példa A 4. példában leírt inkubálási körülmények között a CPC-ből (cefalosporin C-ből) 3% 7-amino-cefalosporánsavat szabadítunk fel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
