202917. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gamma-glutamil-transzpeptidáz előállítására
1 HU 202 917 B 2 6. példa A 7-GTP aktivitásának meghatározása a) HPLC-teszt 50 jxl 80 mN dezacetil-CPC, 100-140 ni 250 mM 5,0 pH-jú kálium-foszfát-puffer és 10-15 pl enzimoldat elegyét 33 °C-on inkubáljuk. 10 percenként 20- 20 pl mintát veszünk. A reakciót 20 pl metanollal félbeszakítjuk, a mintát centrifugáljuk, majd vízzel 1:10 arányban hígítjuk. 10 pl-es minták 7-amino-cefalosporánsav-tartalmát HPLC segítségével mérjük. Álló fázis: C-18-Kieselgél Mozgó fázis: KH2PO4 50 mmólos, vizes-metanolos (80:20) oldata, amely 0,001% tetrabutilammóniumszulfátot tartalmaz. b) Fotometriás teszt 600 pl L-y-glutamil-p-nitroanilid (166 uM) 300 pl káliumfoszfát-puffer (pH 5,7, 50 mM) 100 pl tenyészlé (lásd: L. Jaeniche „Einführung in die Praxis des Biochemikers” Universität Köln, 1984) SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás y-glutamil-transzpeptidáz előállítására, az előállítani kívánt transzpeptidáz- móltömege 60 000 ± 33%,- izoelektromos pontja 5,1 ± 15%,- L-y-glutamil-p-nitroanilid szubsztrátum esetén pH optimuma 6,5 és 10 közötti, Km-értéke (Michaelis- Menten-féle állandó) pH 8 mellett 17,8 pM ± 13%,- katalizálja az (I) általános képletú a-amino-adipinil-aminovegyületek, ahol R1 jelentése aminosav, dipeptid, cefém-, cefám vagy a felsoroltak származékai hidrolízisét, azzal jellemezve, hogy Bacillus subtilis törzset tenyésztünk, és kívánt esetben a yglutamil-transzpeptidázt a tenyészetből kinyerjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Bacillus subtilis IFO 3025, IFO 3013 és/vagy IFO 3335 törzsét tenyésztjük. 5 10 15 20 4
