202917. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gamma-glutamil-transzpeptidáz előállítására
1 HU 202 917 B 2 A találmány tárgya eljárás y-glutamil-transzpeptidáz előállítására. A y-glutamil-transzpeptidázok (az alábbiakban y- GTP) az állati szövetekben, de mikroorganizmusokban is fontos szerepet játszanak az aminosav-anyagcserében, valamint a glutation-ciklusban [Meth. Enzymol. 77., 237 (1981)]. A y-glutamil-transzpeptidázok különböző aminosavak y-glutamil-származékai formájában történő szállítását, bacillusokban a poliglutaminsav képződését, valamint a glutation (y-glutamil-ciszteinilglicin) bontását szabályozzák. A 275 901 sz. európai szabadalmi leírásban (1988. 07. 17.) már javasolták a y-GTP alkalmazását adipinilvagy glutaril-monoamino-vegyületek hidrolizálására. A y-GTP előállítására ismert eljárások - mikrobiológiai eljárások, különböző mikroorganizmusokat alkalmaznak az enzim termelésére (2 723 463 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat; 21097/1986 sz. japán szabadalmi bejelentés). Az eljárások közös hátránya, hogy az enzimaktivitás a biomasszában, a sejteken belül marad, ezért az enzim csak számos tisztítási lépés után, illetve a japán eljárás szerint kloroformos extrahálás útján kapható. Azt találtuk, hogy újszerű y-GTP nyerhető, mégpedig közvetlenül a tenyészléből. Az új y-GTP-re jellemző, hogy- móltömege 60 000 ±33%,- izoelektromos pontja 5,1 ±15%,- L-y-glutamil-p-nitroanilid szubsztrátum esetén pH optimuma 6,5 és 10 között, Km-értéke (Michaelis- Menten-féle állandó pH-8 mellett 17,8 |iM ± 13%, - katalizálja az (I) általános képeiül a-amino-adipinil-aminovegyületek, ahol R1 jelentése aminosav, dipeptid cefém-, cefám vagy a felsoroltak származéka, hidrolízisét. Az eljárásra jellemző, hogy Bacillus subtilis törzset tápközegben a fenti y-GTP feldúsulásáig tenyésztünk. Az (I) általános képlett! vegyületek hidrolízisének katalizálása azért meglepő, mert mind ez idáig azt tételezték fel, hogy a y-GTP aktív centruma sem a Casern a Q-oldalláncokat nem akceptálja (Agric. Bioi. Chem. 42, 1978, 371-381. old.). Az alábbiakban a találmányt közelebbről ismertetjük. A találmány szerint előállított y-GTP az (I) általános képlett! y-amino-adipinil-amino-vegyületek hidrolízisét katalizálja; a hidrolízis végterméke a megfelelő sav, valamint a monoamino-vegyület. Szubsztrátumként előnyösen 7-aminocefalosporánsav-származékokat alkalmazunk. Az enzim mikroorganizmusokban periplazmásan és extracellulárisan fordul elő. Móltömege 40 000 és 80 000 közötti, előnyösen 50 000 és 70 000 közötti, különösen előnyösen 55 000 és 65 000 közötti érték; izoelektromos pontja pH 4,4 és pH 5,9 közötti, előnyösen 4,8 és 5,5 között van. L-y-glutamil-p-nitro-anilid szubsztrátum esetén a pH-optimum 6,5 és 10 között van. Ugyanerre a szubsztrátumra a találmány szerint előállított transzpeptidáz Km-értéke 9-36 pM, különösen 17,8 pM, pH 8 mellett. Az azaszerin vagy jódacetamid jelenléte a találmány szerinti előállított y-transzpeptidázt irreverzibilisen gátolja. Réz, higany, valamint szerin és borát keverékének, illetve 7-amino-cefalosporánsav jelenlétében az enzim reverzibilis gátlást mutat. A y-GTP előállítása mikroorganizmusok segítségével történik, a 275901 sz. európai szabadalmi leírás szerint. A Bacillus subtilis baktériumokat tápközegben tenyésztjük, míg a y-GTP fel nem dúsul a közegben. Különösen előnyösek az Institute for Fermentation Osaka (IFO) (Japán) gyűjteményben 3025, 3013 és 3335 szám alatt letétbe helyezett törzsek. A megnevzett mikroorganizmusok mutánsai és variánsai szántén alkalmazhatók. A mikroorganizmusok felszaporítása aerob körülmények között, külön-külön vagy vegyes tenyészetben történik, például süllyeszett, rázott kultúrában, rázólombik vagy fermentor alkalmazásával, adott esetben levegő vagy oxigén bevezetése mellett. A fermentálást mintegy 20 °C és 37 °C közötti hőmérséklet-tartományban, előnyösen 25 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten, különösen előnyösen 28-30 °C-on végezzük. A fermentálás pH-értéke 5 és 8,5 közötti, előnyösen 5,5 és 8,0 között. A fenti körülmények között a tenyészlében 1-3 nap elteltével lehet kimutatni az enzim feldúsulását. A y-GTP szintézise a késői log-fázisban kezdődik. Maximumát az egyensúlyi növekedési fázisban éri el. Az enzim termelését aktivitás-tesztek segítségével pl. nagynyomású folyadék-kromatográfiásan vagy fotometriásan követhetjük. A y-GTP termelésére felhasznált tápoldat 0,2-5%, előnyösen 0,5-2% szerves nitrogénvegyületet, valamint szervetlen sókat tartalmaz. Szerves nitrogénvegyületként aminosavak, pepton, húskivonat, őrölt magok, így kukorica, búza, szója vagy gyapotmag, az alkoholgyártás desztillációs maradékai, húsliszt vagy élesztőkivonatok jöhetnek számításba. Szervetlen sóként a tápoldat, például az alkálifémek, alkáliföldfémek, vas, cink és mangán kloridjait, karbonátjait, szulfátjait és foszfátjait, továbbá ammóniumsókat és nitrátot tartalmazhat. A biomassza hozamát növelhetjük, ha asszimilálható szénhidrátot adagolunk. A szénhidrát mennyisége szintén néhány százalék. Előnyösen szénforrások például a cukrok, így glükóz vagy szacharóz, valamint szénhidrát-tartalmú természetes anyagok, például malátakivonat. Az optimális fermentációs körülmények az alkalmazott mikroorganizmustól függően más és más, de a szakember ezeket a körülményeket ismeri, illetve előzetes kísérletekben könnyen megállapíthatja. A tisztítás a szokásos módon, azaz lizozimes feltárás, ammónium- szulfátos kicsapás, ioncserélő vagy gélpermentációs kromatográfia útján történik. Az enzimet ismert módon immobilizálhatjuk (Colowick és Kaplan, Meth. Enzymol., Vol. XLIV). Az enzimes reakcióhoz szabad vagy immobilizált egész sejteket alkalmazhatunk, amikor is P-laktámázgátlót, például klavulánsavat vagy tienamicint adagolunk; alkalmazhatjuk az izolált enzimet is, szabad vagy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
