202916. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gamma-glutamil-transzpeptidáz mikrobiológiai előállítására
1 HU 202 916 B 2 adagolásával, mind az izolált végterméket, amelynek ugyancsak hordozóhoz kötöttnek kell lenni, adagolhatjuk. A teljes sejtek immobilizálására megfelelő anyagok például a kitozán, alginát, y-karragenán, poliakrilhidrazid és egyéb, irodalomból ismert anyagok [K. Venkatsubramanian Immob. Cells, ACS Symposium Series, 106. old. (1979)]. A találmány szerinti y-GTP különösen jelentős cefalosporin C-ből történő 7-amino-cefalosporánsav kinyerésére, ugyanis a 2 219 454 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratból ismert egy élesztő, a Trigonopsis variábilis, melynek segítségével nagy kitermeléssel lehet Cefalosporin C-ből glutaril- 7-amino-cefalosporánsavat előállítani. Ennek enzimes hidrolízise azonban mind ez idáig nem megoldott. A találmány szerint előállított új y-glutamil-transzpeptidáz előnye abban áll, hogy felhasználható a glutaril- 7-amino-cefalosporánsav hidrolízisére, amikor is magas hozammal (70%) nyerhető a félszintetikus cefalosporinhoz technikailag fontos kiindulási 7-amino-cefalosporánsav. A következő példákban a találmányt részletesebben leírjuk. A százalékos adatok tömeg%-ot jelentenek, ha mást nem tüntettünk fel. 1. Példa A y-GTP-t termelő mikroorganizmusokat a következő összetételű ferde agaron tenyésztjük: glükóz 1 kazeinpepton 0,4 húsextraktum 0,4 élesztőextraktum 0,05 májextraktum 0,05 NaCl 0,25 pH-7,2 A ferde csövekben két napig 28 "C hőmérsékleten kultúrát tenyésztünk. Ezután a sejteket 10 ml fiziológiai konyhasóoldattal szuszpendáljuk, majd ebből a szuszpenzióból 1 ml-t 50 ml előtenyészet beoltására 300 ml térfogatú Erlenmeyer lombikba teszünk. Az előtenyészet összetétele: tömeg% pepton 1 malátakivonat 0,5 pH-7,0 A lombikot 190 ford/perc-en egy rotációs rázógépen 24 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ebből a tenyészetből 2,5 ml-t 50 ml főkultúra beoltásához felhasználunk: 5 10 15 20 25 A főkultúra összetétele: A) Gramnegatív baktériumok esetén: B) Bacillusok esetén: Pepton 1% Pepton 0,12% Húsextraktum 0,5% Élesztőkivonat 0,12% NaCl 0,5% Glükóz 0,25% KH2PO4 0,1% Na-laktát (60%) 5,6 ml K2HPO4 0,1% NH4CI 0,12% MgS04*7H20 0,05% K2HPO4 0,12% pH-7,0 KH2 PO4 0,034% MgS04*7H20 0,025% NaCl 0,5% KC1 0,5% CaCl2*2H20 0,0015% MnCl2*4H20 0,0007% Fe(NH4 )citrát 0,00015% A kultúrát 24 órán keresztül 28 "C hőmérsékleten 190 ford/perc rázással inkubáljuk, majd centrifugálással a felülúszót elválasztjuk. y-GTP-t termelhetünk az alábbiakban felsorolt mikroorganizmusokkal. 50 A következő táblázatban néhány törzs segítségével termelt y-GTP titerét közöljük. Törzs y-GTP aktivitás (mU/ml 55 tenyészoldat) Ps. putida ATCC 17390 13 Ps. aeruginosa NCTC 10701 11 Proteus vulgaris ATCC 9634 26 60 Törzs y-GTP aktivitás (mU/ml tenyészoldat) Arthrobacter parafineus ATCC 31917 Ps. fragi DSM 3883 37 B. subtilis IFO 3025 31 2. példa Az 1. példa analógiájára Pseudomonas fragi DSM 3881-val előkultúrát készítünk. Ebből a kultúrából 50 ml-t oltóanyagként alkalmazunk egy 5 1-es fermentorban lévő 2 1 főtenyészoldathoz. A törzs tenyésztését 3
