202916. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gamma-glutamil-transzpeptidáz mikrobiológiai előállítására
1 HU 202 916 B 2 28 °C hőmérsékleten és 70%-os parciális oxigén nyomás alatt végezzük. A y-GTP képzését fotometriás méréssel követjük. A tenyészetet maximális enzimtitemél leszedjük. Az említett feltételek között a y-GTP-titere 50 mU/ml tenyészoldat. 3. példa A 2. példa szerint kapott sejtekből 2 g-ot a következő összetételű 2 ml feltárópufferral elegyítünk. 20 mM TRIS-puffer pH-8,0 10 mM EDTA pH-7,6 12 mM MgS04«7H20 Szuszpendálás után a következő adalékokat alkalmazzuk: Lizozim: 0,8 mg/ml DN-áz: 10 mg/ml, ebből 30 pl-t adunk 1 ml szuszpenzióhoz. Az inkubálást szobahőmérsékleten 15 percig folytatjuk. A lizált sejteket 30 000 g-n kicentrifugáljuk. A felülúszót térfogatának 20%-ával azonos térfogatú 2%-os protaminszulfát oldattal elegyítjük. A csapadékot centrifúgálás után eldobjuk. A felülúszót frakcionált ammónium-szulfátos kicsapásnak vetjük alá (50— 80% telítés). Az így kapott csapadékot az eredeti térfogat 1/20-ában, 0,1 M citrátpufferral (pH-5,0) szuszpendáljuk. Ezután egy órán keresztül 37 °C hőmérsékleten hőkezelést alkalmazunk, a szuszpenziót centrifugáljuk és 20 mM citrátpuferral (pH-5,0) szemben dializáljuk. A visszatartott oldatot karboxi-metil-cellulóz oszlopra visszük. 1 ml enzimoldathoz 6 ml CM-cellulóz 52-t (WHATMAN-termék) alkalmazunk. Eluensként lineáris konyhasóoldat gradienssel (0-0,5 M) 20 mM citrátpuffert (pH-5,0) alkalmazunk. Az aktív frakciókat (HPLC-vizsgálat) 10 mM TRIS- puferral pH-8,0 szemben dializáljuk és egy DEAE- cellulóz kolonnán (DE 52 WHATMAN) tovább tisztítjuk. Eluensként lineáris NaCl gradienssel (0-0,3 M) 20 mM TRIS-puffert (pH-8,0) alkalmazunk. A legaktívabb frakciókat (fotometriás vizsgálat) a további vizsgálatokhoz alkalmazzuk. 4. példa 1 ml 3. példa szerint előállított enzimkészítményt 5:1 arányra töményítjük és agaróz-oszlopra (Superose 12, Pharmacia) adjuk. Mozgó fázisként 50 mM kálium-foszfát-puffert (pH-7,0), 0,15 M NaCl-dal alkalmazunk. Az áramlási sebesség 0,3 ml/perc. A y-GTP-t 15,4 ml pufferral eluáljuk. A y- GTP-t L-y-glutamil-p-N02-aniliddel és a glutaril-7-amino-cefalosporánsavnak 7-amino-cefalosporánsavra történő hasításával mutatjuk ki. A y-GTP molekulatömege 30 000- 35000 D. 5 5. példa A 2. példa szerint előállított biomasszát a 3. példa alapján a hőkezelésig feldolgozzuk. Ezután 20 mM kálium-foszfát-puffetTal (pH-5,5) ellenáramban dializáljuk. A visszatartott oldathoz annyi karboxi-metil-cellulózt (CM 52, WHATMAN) adunk, amíg a felülúszó laktázmentes lesz. Ezután 10 mM TRIS (pH-8,0) pufferral ellenáramban dializáljuk, majd DEAE-cellulóz oszlopon (DE 52, WHATMAN) négyszeres térfogatú eluenssel kromatografáljuk. Az eluáláshoz 20 mM TRIS-puffert (pH-8,0) és ezen kívül lineáris gradienssel 0-0,1 M NaCl-ot alkalmazunk. Fotométeres vizsgálattal meghatározzuk az aktív frakciókat, amely szerint az enzim 80%-os ammónium-szulfáttal kicsapódik. A pellettet 50 mM kálium-foszfát-pufferral (pH-7,0) és 0,15 M NaCl-dal feloldjuk (25:l-re töményített). További tisztítást dextránból és akrilamidból álló kopolimerrel (Sephacryl, Pharmacia) töltött kolonnán végezzük. 3,5 ml koncentrátumhoz 2,5*82 cm-es kolonnát alkalmazunk. Az eluens puffer 50 mM káliumfoszfát-puffer (pH-7,0). A HPLC-vizsgálattal mért aktív frakciókat ammónium-szulfáttal töményítjük. A pellettet 20 mM kálium-foszfát-pufferban (pH-6,0) feloldjuk. 6. példa Glutaril-7-amino-cefalosporánsav preparatív átalakításához a következő öszetételtf elegyet alkalmazzuk: 100 pl enzimkoncentrátum, (a 3. példa szerint előállítva) és 100 pl 40 mM glutaril-7-amino-cefalosporánsav [20 mM kálium-foszfát-pufferban (pH-6,0) oldva] amelyet 33 °C hőmérsékleten inkubálunk. Minden órában aliquot mennyiséget leszedünk és a 7 amino-cefalosporánsav keletkezését HPLC-vel ellenőrizzük. Körülbelül 2,5 óra múlva az elegy 52%-a átalakul. Ha a pH-t fokozatosan 7,0-ra növeljük, 8 óra múlva 70%-os átalakulás megy végbe. 7. példa y-GTP aktivitásának meghatározása a) HPLC-vizsgálat 50 pl 80 mM glutaril-7-amino-cefalosporánsavat 100-140 pl 250 mM kálium-foszfát-pufferral (pH-5,0) és 10-50 pl enzim-oldattal elegyítünk és 33 °C hőmérsékleten inkubálunk. 10 percenként 20 ples mintákat szedünk le. A reakciót 20 pl metanollal leállítjuk. A reakcióelegyet centrifugáljuk és 1:10 arányban vízzel hígítjuk. 10 pl mintát HPLC-vel 7- amino-cefalosporánsav-tartalomra vizsgálunk. Álló fázis: C-18-szilikagél mozgó fázis: 50 mM vízben oldott KH2PO4, metanol (80:20)+0,001% tetrabutil-ammónium-szulfát. b) Fotometriás vizsgálat 600 pl 166 pM L-y-glutamil-p-nitro-anilidet, 300 pl 50 mM kálium-foszfát-puffert (pH-5,7) és 100 pl tenyészoldatot elegyítünk és 37 *C hőmérsékelten inkubálunk. (ahol 9620 a 7-amino-cefalosporánsav moláris extinkciós koefficiensét, e pedig a mért extinciót jelöli). 8. példa Glutaril-aminosav-származékok hidrolízise 50 pl-t veszünk ki egy 80 mmól/1 tömegegységű glutaril-mono-amino-származék oldatból; ehhez 100-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
