202885. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proburzin és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

1

HU 202 885 B

2

I. táblázat

Probuizin tisztítása szarvasmarha-embrió májból

Tisztítási lépés

Teljes

proburzin

(mg)

Teljes

protein

(mg)

Proburzin

(%)

Tisztítási

fok

(%)

Kitermelés

Embrió máj (nedves tömeg, 500 g)-73400-A

Gélszűrés, Sephadex G-75

92,6

7400

1,25

1

100

B

Ioncsere, CM Sephadex

28,7

950

3

2

31

C

Vékonyréteg-kromatográfia*

6,4

91,2

7

5

7

D

Gélszűrés, Sephadex G-25

2,6

27,4

10

8

2,8

E

Anioncsere FPLC, Mono-Q

2,1

5,3

40

32

2,3

F

Reverz fázisú FPLC

1,4

1,5

93

74

1,5

* A burzint, amely hozzájárult az immunreaktivitáshoz, eltávolítottak ebben a lépésben.

2. példa

ELISA

A) Nyúl antiszérum

Nyúl immunizálásához a proburzint kürtöscsiga hemocianinnal (KLH) kapcsoljuk l-etil-3-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimiden (ECDI) keresztül Tanúira és munkatársai módszerével [Cell, 34:587 (1983)].

A módszer röviden a kővetkező: 5 mg burzint feloldunk 400 pl vízben, amelyet sósavval pH-3,0 értékre savanyítunk, majd jégfürdőn lehűtjük. Hozzáadunk 10 mg ECDI-t 20 pl térfogatban, és a kapott elegyet 15 percig jégfürdőn inkubáljuk. Az elegyhez ezután hozzáadunk 15 mg KLH-t 0,5 ml pH-3,0 étékre savanyított vízben. Az oldathoz ezután hozzáadunk 0,5 ml telített ammónium-karbonát-oldatot, és egy kis mennyiségű száraz ammónium-karbonátot adunk hozzá, hogy az oldat telített legyen. Az elegyet 3 óra hosszat inkubáljuk jégfürdőn keverés közben, majd 2 liter vízzel szemben dializáljuk 40-48 óra hosszat, mialatt a vizet háromszor cseréljük, majd egy éjszakán át PBS-sel szemben dializáljuk. A konjugátamot PBS- sel hígítjuk 1 mg/ml burzin értékre.

200 pg KLH-burzint 200 pl-ben keverünk 400 pl komplett Freund-féle adjuvánssal. 500 pl szuszpenziót használunk öt nyúl szubkután immunizálására. 4-6 hetes időközökben a nyulak provokáló immunizálást kapnak hasonló szuszpenzióval, amely inkomplett Freund-féle adjuvánst tartalmaz,

B) ELISA előírás

Az antiszérumokat a következő módszer szerint vizsgáljuk. A vizsgálatokat Voller és munkatársai módszerével végezzük [Bull. WHO, 53:55, (1976)]. A módszer röviden a következő: polivinil- klorid mikrotiter lapokat (Fisher Scientific, Springfield, NJ) egy éjszakán át befedve tartunk 100 pl/mélyedés mennyiségű 10 pg/ml koncentrációjú tetramer proburzin oldattal 0,5 mól/l-es foszfát-pufferben (pH-7,2). A lapokat ezután mossuk, és 150 pl/mélyedés 0,5%-os szarvasmarha szérum albuminnal (PBS-ben, pH-7,2) 1 óra hosszat szobahőmérsékleten rétegezzük. A lapokat

mossuk, 37 °C-on 6-24 óra hosszat szárítjuk, majd száraz csomagolásban lezárjuk, és 4 'C-on tároljuk.

A vizsgálandó antiszérumokat 0,05% Tween 20-t tartalmazó PBS-vel hígítjuk. 100 pl hígított szérumot juttatunk minden mélyedésbe, három párhuzamos helyre. Negatív kontrollként normál nyúl vagy egérszérumot alkalmazunk. 60 percig szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a lapokat háromszor mossuk Tween 20-t tartalmazó PBS-vel. Ezután minden mélyedéshez hozzáadunk 100 pl affinitáskromatográfiával tisztított kecske anti-nyúl IgG-vel kapcsolt, (nehéz és könnyűlánc) alkálikus foszfatázt, amelyet Tween 20-t tartalmazó PBS-vel 1:2000 arányban hígítottunk. A lapokat szobahőmérsékleten 60 percig inkubáljuk. A lapokat ezután 100 pl 1 mg/ml koncentrációjú para-nitro-fenil-foszfát dietanol-amin-pufferes oldatával mossuk. 30 percig szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a reakciót 50 pl/mélyedés 5 n nátrium- hidroxiddal leállítjuk, és az optikai sűrűséget 410 nm-nél mérjük.

C) Eredmények

Öt nyúl közül kettő a proburzinnal szemben antitestet termelt 5 hónap alatt, a titer mintegy 1:800 volt (3A ábra). Az anti-burzin antiszérum kötését a KLH- burzin blokkolta, a szabad proburzin szintén, a KLH- kontroll konjugátum azonban nem (3B ábra).

3. példa

N-terminális protein szekvencia meghatározás automatával

Érintetlen proburzin és proburzin triptikus és ciánbromidos fragmenseinek szekvencia-analízisét gázfázisban végeztük egy Polybren hordozóval töltött 470A típusú Applied Biosystems gázfázisú szekvenáló segítségével standard egyszeres kapcsoló- egyszeres hasítóprogrammal. A kapott aminosav-fenil-tio-hidantion származékokat HPLC útján azonosítottak egy 1084B Hewlett Packard nagynyomású folyadékkromatográffal. Az eredményeket a 4. ábra mutatja.

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6