202885. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proburzin és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 885 B 2 4. példa A peptid előállítása szintetikus úton A pepiidet szilárd fázisú módszerrel egy ABI 430 típusú peptidszintetizálóban állítottuk elő BOC-aminosav-származék előírás szerint. A szintézist 0,50 mmól BOC-(Tos)Arg-PAM gyantával kezdtük. A kapott peptid-gyanta mennyisége 1,87 g volt. A gyantát 20 ml hidrogén-fluoriddal és 2 g p-krezollal kezeltük 0 "C-on 1 óra hosszat. A hidrogén-fluoridot csökkentett nyomáson eltávolítottuk, és a maradékhoz etil-acetátot adtunk. Az elegyet szűrtük, és etil-acetáttal mostuk. A szilárd fázishoz trifluor-ecetsavat adtunk, és az elegyet leszűrtük. A szűrletet kis térfogatra bepároltuk, majd étert adtunk hozzá. A csapadékot leszűhük, és alaposan mostuk éterrel, így 1,04 g fehér szilárd terméket kaptunk. 440 mg kapott terméket hozzáadtunk 50 ml 1 mól/l-es ammónium-hidrogén-karbonát-oldathoz (pH-9,0) a Trp deformilezése céljából. Az oldatot nitrogén átbuborékoltatásával oxigénmentesítettük, és egy lezárt lombikban 16 óra hosszat állni hagytuk. Az oldatot ezután vízzel hígítottuk, és liofilizáltuk. A peptidet preparatív HPLC útján tisztítottuk egy Partisil-ODS M-20 oszlopon, és 20% acetonitrilt és 0,1% TFA-t tartalmazó oldattal eluáltuk. A peptidet hígított TFA segítségével feloldottuk körülbelül pH-3 értéknél, és 5 részletben vittük fel az oszlopra. Az eluálással kapott főcsúcs középső frakcióit egyesítettük, a szerves fázist forgó bepárlóban eltávolítottuk, és a maradékot liofilizáltuk. A terméket acetátsóvá alakítottuk egy Amberlite IR-68 anioncserélő oszlopon. A következő szekvenciával rendelkező termék mennyisége 102 mg volt: fenil-alanil-fenil-alanil-triptofíl-lizil-treonil-lizihpropil-arginil-lizil-hisztidil-glicil-glicil-arginil-arginin. TLC (szilikagél 60): Rf 0,10 n-BuOH:HOAc:H20-pyr 4:2:3:1 Rt 0,04 EtOAc:pyr:HOAc:H20 5:5:1:3. Aminosav-analízis: Thr - 0,88, Pro - 1,04, Gly - 2,01, Phe - 2,00, His - 1,02, Lys-2,91, Trp-0,81, Arg-3,14; 73% peptid. 5. példa Biológiai aktivitás - ciklikus GMP vizsgálat T. Audhya és munkatársai módszerével [Arch. Biochem. Biophys., 243 :167-177 (1984)] Daudi-sejteket frissen oltottunk és tenyésztettünk 2 napig, majd a sejteket összegyűjtöttük, és háromszor mostuk PBS- vel, majd RPMI 1640 tápközegben szuszpendáltuk 1,0»105 * 7 sejt/ml koncentrációban, és 30 percig 37 °C-on hagytuk kiegyenlítődni. Ezután hozzáadtunk 25 pl vizsgálandó burzint és proburzint, valamint kontrollként (A) sertésinzulint, (B) ló mioglobint és (C) szarvasmarha növekedési hormont. Az elegyeket 4-5 percig rázatott vízfürdőben inkubáltuk, majd 1 ml jéghideg TCA-val (10%) leállítottuk a reakciót. A sejteket a TCA-ban homogenizáltuk, és ultrahanggal kezeltük a ciklikus nukleotid felszabadítása érdekében. A szuszpenziót 3000 g-vel 20 percig 4 *C-on centrifugáltuk. A kapott csapadékot 0,1 n nátrium-hidroxidban oldottuk a proteintartalom meghatározásához. A felülúszóból a TCA-t 4x5 ml vízzel telített dietil-éterrel végzett extrahálással eltávolítottuk. Az utolsó extrakció után az étemyomokat 10 percig 50 "C-on vízfürdőn végzett melegítéssel eltávolítottuk. A mintákat liofüizálás után 50 mmól/l-es acetát-pufferrel (pH-6,2) rekonstituáltuk a ciklikus GMP radioimmun vizsgálattal történő meghatározásához. 0 és 1000 pg/ml koncentrációértékek között kiértékeltük a dózis válaszgörbéket burzin, proburzin és a kontrollok esetén. Az 5. ábra a tipikus dózis-válasz görbéket mutatja aktív burzin és proburzin, valamint az inaktivált vegyületek esetén Daudi-sejtekben (5A ábra) és MOPC 315-sejtekben (5B ábra). Minden vizsgált peptid esetén meghatároztuk a küszöbaktivitást. Ez a vizsgált peptid azon legalacsonyabb koncentráció értéke (1 pg/ml), amely a ciklikus GMP olyan intracelluláris szintjét indukálta, amely a kontrollértéket a standard eltérés kétszeresével haladta meg. A kontrollok intracelluláris ciklikus GMP értéke kisebb, mint 0,1 pmól/ml (átlaglstandard eltérés) volt. A teszteredményeket akkor tekintettük pozitívnak, ha a ciklikus GMP szintje nagyobb volt, mint a paralel negatív kontroll esetén mért érték 1,52-szerese (2 standard eltérés). 6. példa Biológiai aktivitás - növekedési hormongátlás Vizsgálatot végeztünk a proburzin és a növekedési hormon felszabadító faktor (GRF) hatásának tanulmányozására, mivel ez a kombináció szabadítja fel a 3H-inozit-foszfátot (IP) és akkumulálja a növekedési hormont (GH) SV40-vel transzformált hörcsög-bétasejtekben (HIT). A kísérletet MJ. Benidge és munkatársai fent idézett helyen ismertetett módszerével végeztük. A kísérletet, a kővetkezőképpen végeztük: kereskedelemben kapható HIT-sejteket inkubáltunk 37 "C-on 1 óra hosszat 5% borjúembrió-szérumot (FCS) tartalmazó metabolikus RPMI tápközegben. Az alábbi táblázatban jelzett koncentrációban GRF-t adtunk a sejttenyészetekhez, és 15 percig 37 "C-on inkubáltuk. A sejteket ezután 800 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, és a felülúszót összegyűjtöttük. A felülúszóban a GH és IP szinteket radioimmun vizsgálattal (RIA) határoztuk meg szintén Berridge és munkatársai módszerével. Ezek a mérések képezték a GRF kontrollt. Ugyanezt az eljárást végeztük GRF adagolása nélkül, ezt a táblázatban kontrollként jelöltük. Hasonlóképpen a proburzinnak a GRF-re gyakorolt hatása vizsgálatához a fenti eljárást követtük, azzal az eltéréssel, hogy a GRF-t és a proburzint egyszerre adagoltuk a sejtekhez, majd 15 percig inkubáltunk és centrifugáltunk. A felülúszó RIA vizsgálatával meghatároztuk a IP és GH koncentrációkat, amelyeket az alábbi táblázatban foglaltunk össze. A táblázat adataiból látható, hogy a proburzin jelentős gátlóhatást fejt ki a növekedési hormont felszabadító faktorra, hasonlóan ahhoz, amint ezt Hill és munkatársai szomatosztatin esetén meghatározták. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
