202885. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proburzin és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 885 B 2 ké. így ezek a betegek krónikus vagy visszatérő baktériumos fertőzésben szenvednek. Más immunhiányosságok, beleértve az immunglobulin termelésének hiányát, vagy csökkent voltát, szintén megközelíthetők a találmány szerinti eljárással előállított peptidekkel történő kezeléssel, attól függően, hogy hol helyezkedik el a problémát okozó immunológiai hiányosság. Ha a hiányosság a pre-B-sejt érett antitest kiválasztó B-sejtté történő érésében fordul elő, a találmány szerinti eljárással előállított peptid használható. Az immunhiányosságok kezelése terén jártas szakemberek képesek diagnosztizáni a proburzinnal kezelendő betegséget okozó hiányosság helyét. Lásd például „Basic and Clinical Immunology”, Kiadó: Sütés, Stobo, Fudenberg és Wells, 4. kiadás (1982) Lange Medical Publications, Los Altos, California (Chapter 25). Emellett úgy találtuk, hogy a proburzin gátolja a növekedési hormon felszabadulását (6. példa). A növekedési hormon gátlása öszefügg bizonyos rákos daganatok növekedésének gátlásával [lásd például R.S. Hill és munkatársai, Diabetes, 34:115 (1985) és M.J. Berridge ^ és munkatársai, Biochem. J., 212:473 (1983)]. így a proburzin és/vagy analógjai vagy módosított változatai terápiásán alkalmazhatók bizonyos rákos megbetegedések esetén, ahol a daganatok növekedését növekedési hormonnal végzett szabályozással gátolják. A proburzin és analógjai diagnosztikai szerként is alkalmazhatók, például ha radioaktív vagy más detektálható jelzéssel látjuk el azokat. Ezenkívül a proburzin és analógjai alkalmazhatók antigén anyagokként poliklonális vagy monoklonális antitestek előállításához ismert módszerekkel, mint például Köhler és Milstein hibridóma módszere. Az említett betegségek és állapotok kezelésére a találmány szerinti eljárással előállított peptidekből terápiásán hatásos mennyiséget adagolunk a kezelendő személynek vagy állatnak. Terápiásán hatásos menynyiségen olyan mennyiséget értünk, amely hatásos a máj vagy az immunrendszer említett betegségeinek, illetve hiányosságainak kezelésében. A találmány szerinti eljárással előállított peptidek esetén ez a terápiásán hatásos mennyiség kb. 1 pg/kg és 10 |ig/kg közötti. A proburzin maximálisan aktív 100 pg/kg-ig. Az immunhiányosságok kezelése terén jártas szakember az említett adatok alapján meg tudja állapítani az alkalmas dózist a megfelelő klinikai használathoz. így például egy gyakorló kezelőorvos a szokásos klinikai paraméterek alapján meg tudja határozni a dózist, ide tartoznak a kor, testtömeg, nem és a beteg általános fizikai állapota. A találmány szerinti eljárással előállított pepiidet, illetve gyógyászati készítményt előnyösen parenterálisan alkalmazzuk, mivel a szekvencia az emésztőenzimek által degradálódhat Az adagolás legelőnyösebb módja a szubkután, a peptid adagolható azonban peikután, intramuszkulárisan, intranazálisan, intraperitoneálisan, intravénásán, bukkálisan vagy kúp formájában. A találmány szerinti eljárással előállított peptideket tartalmazó gyógyászati készítmények előállíthatók úgy, hogy a pioburzint, mint hatóanyagot alaposan elkeverjük gyógyászati hordozókkal és/vagy egyéb segédanyagokkal a gyógyszeikészítésben szokásos módszerekkel. A hordozók a kívánt adagolási módnak megfelelőén megválasztott készítménytől függően változhatnak, így attól függően, hogy szuszpenziót, elixírt vagy oldatot készítünk. Parenterális készítmények esetén hordozóként rendszerint steril vizet vagy sóoldatot alkalmazunk. További segédanyagokat alkalmazhatunk az oldhatóság biztosítására vagy konzerválás céljából. Injektálható szuszpenziókat alkalmas folyékony hordozószerekkel, szuszpendálószerekkel, stb.-vel készíthetünk. A területen jártas szakember számára kézenfekvő az ilyen kompozíciók előállítása. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük közelebbről a korlátozás szándéka nélkül. 1. példa Burzin és proburzin nyers extrakciója 500 g szarvasmarhaembrió májat extrahálunk 25 tömeg/térfogat%-os ammónium-hidrogén-karbonát-pufferrel (50 mmől/1, pH-8,0), amely 1 mmól/1 polimetilszulfonsavat (PMSF), 1 mmól/1 etilén-diamin-triaecetsavat (EDTA) és 1 mmól/1 béta-merkapto-etanolt tartalmaz. A szövetet 4 *C-on 3 percig homogenizáljuk, majd 4 °C-on 45 percig 9000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszót egy gézen átszűrjük. A tiszta szúrletet -60 'C-on tároljuk. 25 ml aliquotot liofilizálunk, és 10 ml foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) szuszpendáljuk. Az oldatot centrifugáljuk, és 2,5 ml aliquotokat PD- 10 oszlopon (Pharmacia-gyártmány) kromatografálunk. A kis molekulatömegű visszatartott frakciókat liofilizáljuk, és 1 ml ammónium-hidrogén-karbonát-pufferben (50 mmól/1, pH-8,0) feloldjuk, majd a 2. példában ismertetett enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA) vizsgáljuk. A szarvasmarhaembriómájból kinyert proburzint tovább tisztítjuk (A) Sephadex G-75 molekulaszűrő oszlopon (Pharmacia-gyártmány) végzett gélszűréssel, majd (B) CM Sephadex ioncserélő oszlopon (Pharmacia-gyártmány). A burzint, amely a frakció immunreaktivitásához hozzájárul, a következő, (C) vékonyrétegkromatográfiás tisztítási lépésben távolítjuk el. A kapott frakciót (D) újra Sephadex G-75 oszlopon szűrjük, majd (E) a maradék szűrletet anioncserélő gyors protein folyadékkromatográfiának vetjük alá Mono-Q oszlopon (Pharmacia-gyártmány). A tisztítás utolsó lépése (F) a reverz fázisú FPLC. A kitermelést és a tisztítási lépések rendjét az 1. táblázatban foglaltuk össze. A lépésenként tisztított frakciók 254 nmnél mért optikai sűrűségét szintén kiértékeltük. Az A, B, E és F lépések frakcióit az 1. ábra szemlélteti. A 2. ábra a C vékonyrétegkromatográfiás lépés eredményét mutatja. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
