202883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-interferon előállítására és tisztítására
1 HU 202 883 B 2 ral 4 °C-on 10000 ford./perc-nél 1 óra hosszat centrifugáljuk. A tiszta felülúszó, 3120 ml, a nyersextraktumban kinyert interferon 0,7%-át tartalmazza (120xl06 I.E.). Az üledéket 0,01 mólos nátrium-klorid oldattal elegyítjük, és 4-8 °C-on 2 óra hosszat keverjük. A pH-t 5 n nátrium-hidroxid oldattal 7,50-re állítjuk, és az oldatot a fent leírtakhoz hasonlóan tisztára centrifugáljuk. A tiszta oldatot dializálópatron (Nephross Allegro, az Organon Technika cég gyártmánya) segítségével 0,01 mólos nátrium-klorid oldattal szemben 390 mOsmol/lit.-re [Am. J. Physiol., 190., 139 (1934)] dializáljuk. Az interferontartalom 13,3xl09 I.E. (, 77,6%). c) A dializátumot ezután kromatografáljuk (tandemkromatográfia). Az előoszlophoz a Whatman cég által szállított 125 g DE-52-Zellulose port használunk 7,5 pH-jú TRIS/NaCl-pufferban (0,025 mólos TRIS-HC1 + 0,2 mólos nátrium-klorid); ez a mennyiség 0,5 g oszloptöltet/g biomassza aránynak felel meg. Az affinitás-oszlophoz bróm-ciánnal aktivált Sepharose 4 B-hez (Pharmacia cég) kapcsolt monoklonális anti-interferon-IgG-t (EBI 1) használunk. A kész oszlopanyagot nátrium-azidos foszfátpufferolt nátrium-klorid oldatban (PBS) 4-8 °C-on tároljuk. Felhasználás előtt az antitest oszlopot 25%-os etilén-glikollal készített 0,1 mólos citromsavoldattal mossuk, és utána foszfátpufferolt nátrium-klorid oldattal (PBS) semlegesre öblítjük. A biomasszára számolva az antitest-oszlop esetében grammonként 0,2-1,0 ml oszloptérfogatra van szükség. A dializált interferonoldatot ezután mindkét oszlopon (előoszlop és antitestoszlop) átpumpáljuk, és az eluátumot a 280 nm-en mért extinkcióval ellenőrizzük. Az interferonoldat felvitele után az oszlopokat 7,5 pH-jú TRIS/nátrium-klorid puffénál addig mossuk, amíg az eluátum a csúcsérték 1/20-ára esik vissza. Ezt követően az antitest-oszlopot elválasztjuk az előoszloptól, és egyedül addig mossuk 7,5 pH-jú TRIS/NaCl-pufferral, amíg az eluátumban már nem mutatható ki protein. Az antitestekhez kötött interferon elúciója 25%-os etilén-glikollal készített 0,1 mólos citromsavoldattal történik, közben az eluátum extinkcióját ismét 280 nm-en követjük. Az interferont tartalmazó proteincsűcsot összegyűjtjük. így 16,8 ml eluátumot kapunk 12,3x10’ LE. („ 71,9%) interferontartalommal. Az össz-proteinmennyiség 54,4 g, amiből 226xl06 LEJmg protein fajlagos aktivitást számolunk. d) További tisztítás céljából az eluátum pH-ját ammóniával 4,5-re állítjuk, és a keletkező csapadékot elválasztjuk. A tiszta felülúszó (18,3 ml) 46,3 mg proteint tartalmaz és ll,8xl091.E. interferonmennyiséget. Ez a nyersproteinre számítva 69% kitermelésnek felel meg (255xl06 I.E7mg protein). e) Végső tisztításra a Pharmacia cég egy MONOS-oszloppal, Type HR 10/10 (kationcserélő) ellátott FPLC-készülékét használjuk. A lecsapás után kapott tiszta felülúszót felvisszük az előzetesen 4,5-5,0 pH-jú 0,1 mólos ammóniumacetát puffénál mosott oszlopra, és ezt addig mossuk, amíg a 280 nm-en mért extinkció a kiindulási értékhez visszatér. Az adszorbeált interferon elúciója sima sógradienssel (0,1 M-+0,5 M; lásd 5. ábra) történik 4,5- 5,0 pH-jú 0,5 mólos ammónium-acetát puffer hozzákeverésével. Az interferon éles csúcsként eluálódik. Mind a „váll”-frakciót (K3), mind a később eluálódó részeket (K5-K7) elválasztjuk a tiszta interferon főcsúcsától. A tiszta interferon csúcsát összegyűjtjük, és ebből aliquotokat veszünk a HPLC-analízishez, SDS- gélelektroforézishez, proteinmeghatározáshoz, interferon-teszthez és endotoxin-meghatározáshoz. A „váll”frakcióban (9,1 ml) összesen 4,1 mg proteint mutatunk ki; az interferontartalom 1,33x10s I.E. (7,7%). Ebből 324xl061.E./mg protein adódik. A 9,8 ml főmennyiség 5,18xl09 I.E. (30,3%) legtisztább interferont és összesen 16,1 mg proteint tartalmaz; ebből 322xl0é I.E./mg protein fajlagos aktivitás adódik. f) a) Az interferon oldatot legfeljebb 2-2 ml-es adagokban 8 ml-es össztérfogatú autoklávozott lio-ampullákba töltjük, ami ampullánként körülbelül 1-8 mg tiszta interferonnak felel meg. Az ampullákat utána előre elmosott és autoklávozott lio-dugókkal látjuk el, és legalább -20 °C-ra hűtjük. A liofilizácóit -10 *C- on és 133 Pa (1 Torr) alatti nyomáson végezzük. Apufferoldat eltávolítása után a hőmérsékletet 25 'C-ra emeljük, és legalább 1 óra hosszat tovább liofilizáljuk. Utána a vákuumot megszüntetjük, és a dugókat rögtön szorosan bedugjuk. Az ampullákat végül alumíniumkupakokkal ellátva hűtőkamrában vagy -20 °C-on tároljuk. ß) A stabilitás ellenőrzése céljából az 1 .a)-f;a) példától függetlenül, de hasonló módon, négy különböző fermentációs elegyet liofilizálunk. A liofilizátumokat IRMA-hígítópufferban* oldjuk, és az NK2-IRMA** segítségével humán-a-interferonra analizáljuk. * IRMA - immunoradiometric assay; a hígítgópuffer 0,5% borjú széramalbumint és 0,1% nátrium- azid tartósított tartalmazó foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldat; ** NK2-IRMA - a meghatározáshoz használt anti-a-interferon monoklonális antitest [Nature 285, 446-450 (1980)], forgalmazza CELLTECH. charga Interferon-titer liofilizálás előtt Interferon-titer liofilizálás után ±% A 720xl06 754x106 +5 B 1337xl06 1526xl06 +14 C 981xl06 852x106-13 D 1230xl06 1149xl06-7 A liofilizáció tehát nem okozott veszteséget. A liofilizátumot 11 hónapig körülbelül 4 °C-on (hűtőszekrény) való tárolás után 0,1 mólos ammónium-acetát oldatban oldjuk, és mind tisztaságra (gélpermeációs-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
