202883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-interferon előállítására és tisztítására
1 HU 202 883 B 2 HPLC-vel) mind tartalomra (az NK2-IRMA-teszttel) megvizsgáljuk. A liofilizálás 1 hónap liofilizátumként előtt való tárolás (4 °C) után Tisztaság (gélp.-HPLC) 98,5% 98,7% Interferon-titer 1510xl06 egység/ml 1464x10® egység/ml 2. példa A fermentációs időnek az interferonkomponensek összetételére való befolyásának vizsgálata céljából egy fermentléből (E. coli HB 101; 28 °C) 8, 9, 10 vagy 11 óra múlva mintákat veszünk, a szokásos technika szerint 2 pH-n savval kicsapjuk, és a találmány szerinti módszerrel feldolgozzuk, és analizáljuk. A következő táblázat mutatja a minták Kl, K2 és K3 tartalmát. (KI: metionin-interferon; K2: natív interferon; K3: nem natív interferon). Az értékeket kromatofókuszálás segítségével határoztuk meg. Fermentációs idő (órában) 8 9 10 11 g nedves biomassza tenyészet literenként 14,0 15,0 18,0 21,0 mg interferon/g biomassza (nyersextraktban 0,28 0,21 0,16 0,12 mérve) mg interferon/liter 3,9 3,2 2,9 2,5 tenyészet KI pl - 5,78 0,7% n.k.* 10,7% 19,4% K2 pl - 5,64 96,2% 97,5% 86,1% 78,5% K3 pl - 5,49 3,1% 2,5% 3,3% 2,1% * n.k. - nem kimutatható. 3. példa Az EBI-1 antitest kapcsolása bróm-ciánnal aktivált Sepharose 4B-re (lásd a 33 06 060 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratot). Az EBI-1 antitestet először 8,4 pH-jú 0,5 mólos nátrium-klorid/ 0,2 mólos nátrium-hidrogén-karbonát oldattal (a lehető legkevesebb pufferban) oldjuk, és ezzel a puffénál szemben addig dializáljuk, amíg a külső oldatban bárium-kloriddal már nem mutathatók ki szulfátionok. Az ammónium-szulfát gondos eltávolítása feltétlenül szüksége, mivel ammóniumionok a hordozóhoz való ezt követő kapcsolást zavarják. A proteinkoncentrációt utána a fenti pufferral 5 mg/ml-re állítjuk be. A kapcsoláshoz hordozóként bróm-ciánnal aktivált Sepharose 4 B-t (Pharmacia) használunk. Ezt a gyártó előírása (csomagoláshoz mellékelt megjegyzés) szerint előbb mossuk. 25-25 mg EBI-1 antitesthez 1 g aktivált Sepharose-t használunk. A kapcsolást az előbbi pufferban 8,4 pH-n, szobahőmérsékleten 2 óra hosszat végezzük. Utána az EBI-1 Sepharose-t a csomagoláshoz mellékelt utasítás szerint szűrjük, és mossuk. A szűfletben nem szabad a hozzáadott EBI-1 antitestek 5%-ánál többnek maradni. A kész EBI-l-Sepharose-t nátrium-azidot tartalmazó foszfátpufferolt nátrium-klorid oldatban (PBS/azid) hűtőtérben tároljuk. PBS/azid (foszfátpufferolt nátrium-klorid oldat): PBS: 7,30 g nátrium-klorid a.lt. (Merck 6404) 3,00 g dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát a.lt. (Merck 6580) 1,15 g nátrium-dihidrogén-foszfát-hidrát a.lt. (Merck 6346) vízben oldva, és 1000 ml-re feltöltve; pH 7,0. Azid: A PBS-hez 1,0 g/üt. nátrium-azid a.t.-t (Merck 6688) adunk. A kész oldatot sterilre szűrjük (0,2 mikron pórusméret), és hűtőtérben tároljuk. Interferon antitest meghatározás (semlegesítéses meghatározás). Anyagok: Sejtek: Humán tüdő karcinóma „A-549” sejtek, ATCC CCL 185. Vírus: Enkefalomiocarditis vírus (EMC), ATCC VR 129. Interferon standard: HS-11 (1 ampulla „HS-11” - liofilizált humán ra-A-interferon, felvéve 1,2 ml vízben, 12000 I.E./ml). Szövettenyészet lemezek: 96 csészécske fedővel, sík fenékkel, Coming, New York, No. 25860, csészeátmérő 6,4 mm, szövettenyészettel töltve. Táptalajok: DMEM - Dulbecco módosított Eagle táptalaj glutaminnal, nátrium- hidrogén-karbonát nélkül, Flow Kat. No. 10-331-24 (1F-017D). HEPES Sigma No. H-3375 TRICIN Calbiochem No. 33468, A grade. FCS - borjú magzat szérum, Boehringer Mannheim HUMÁN SZÉRUM-ALB UMIN Behring Inst., 20%, infúziós minőség Antibiotikum, tiamulin-hidrogén-fumarát, Biochemie Kundl/Tirol, Ausztria (Sandoz C.) Tenyésztáptalaj: DMEM + 10% FCS (30 percig 56 'C-on inaktivált), + 13 mmól HEPES + 6 mmól TRICIN + 1,6 g/lit. nátrium-hidrogén-karbonát antitpotikum nélkül pH 7,2-7,4. Meghatározó táptalaj: mint a tenyésztáptalaj, de 10% FCS helyett 5%, és 5 pg/ml tiamulin. Hígító táptalaj: tenyésztáptalaj szérum nélkül 5 jig/ml tianulinnal. Vírus táptalaj: tenyésztáptalaj szérum nélkül 5 pg/ml tiamulinnal és 3,5 mg/ml humán szérumai buminnal. Metilibolya-törzsoldat: Metilibolya Merck No. 1402 6 g, Etanol 100 ml Feloldani, és körülbelül 50 *C-on szúrni. Metilibolya használtra kész oldata: Törzsoldat 50 ml, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
