202883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-interferon előállítására és tisztítására
1 HU 202 883 B 2 az interferont egy gradiensprogramm szerint eluáljuk. Az interferon enyhe vállal rendelkező éles csúcsként eluálódik. Mind a „váll”-ffakciót (K3) mind a később eluálódó részeket (K5-K7) elválasztjuk a tiszta interferontól. A tiszta interferon csúcsát összegyűjtjük, és ebből aliquotokat veszünk a HPLC-analízishez, SDS-gélelektroforézishez, proteinmeghatározáshoz, interferonteszthez és endotoxinmeghatározáshoz. Ezzel a kromatográfiával gyakorlatilag minden komponenst elválasztunk a főcsúcstól, és homogén interferont kapunk, amely a gélpermeációs HPLC-vel 99% feletti monomertartalmat mutat. A fordított fázisú HPLC csak körülbelül 1%-nyi nem-natív monomert mutat, a kromatofókuszálás pedig 2,5% nem-natív momer jelenlétét. A MONO-S-oszlopot az újbóli használat előtt 8,0 pH- jú 0,5 mólos nátrium-klorid + 0,1 mólos nátrium-foszfát oldattal mossuk, hogy az adszorbeált szennyezéseket eltávolítsuk; az oszlopot 25%-os etanolban tároljuk. Az illékony puffer liofilizálással tökéletesen eltávolítható. Ezért az inteferonoldatot legfeljebb 2-2 ml-es adagokban 8 ml össztérfogatú autoklávozott lio-ampullákba töltjük; ez ampullánként körülbelül 1-8 mg tiszta interferonnak felel meg. Az ampullákat utána előmosott és autoklávozott lio-gumidugókkal látjuk el, és legalább -20 'C-ra hűtjük. A liofilizálás -10 °C-on és 133 Pa-nál (1 Torr) kisebb nyomáson történik. A pufferoldat eltávolítása után a hőmérsékletet 25 °C-ra emeljük, és még legalább 1 óra hosszat liofilizálunk. A vákuumot megszüntetjük, és a dugókat azonnal szorosan benyomjuk. Végül az ampullákat alumíniumkupakokkal ellátva hűtőtérben vagy -20 °C-on tároljuk. Amint kiderült, megfelelően végzett fermentációvezetéssel (viszonylag korai kinyerés) és a találmány szerinti eljárással együtt először volt lehetséges olyan a-interferont előállítani, amely nemcsak interferon-tartalom szempontjából 98% feletti tisztaságú, hanem a különböző interferonkomponensekre vonatkoztatott homogenitás szempontjából is 95%-nál több natív monomer a-interferonból áll. Ez a magas tisztasági és homogenitási fok teszi lehetővé azt is, hogy az interferont először nyerjük ki sóktól és pufferalkotórészektől mentesen, szilárd formában. Először vált lehetségessé, hogy a-interferont hónapokon keresztül stabilizátorok nélkül tároljunk, ami a tárolás, szállítás és nem utolsó sorban a galenusi fejlesztés részére jelentős előnyöket nyújt az eddig mindig albuminnal stabilizált interferonokkal szemben. Még 11 hónap 4 °C-on való tárolás után sem volt megállapítható tartalomcsökkenés. A találmány szerint előállított a-interferont, amint ismeretes, emberi szérumalbumin hozzáadásával oldjuk, sterilre szűrjük, és aszeptikusán szétosztjuk üvegcsékbe az alkalmazástól függően megfelelő koncentrációkban. A klinikai vizsgálatok során a találmány szerint előállított a-interferon nem-immunogénnek és kiválóan elviselhetőnek bizonyult. 1985. januárig összesen 75 pacienst kezeltek a nemimmunogén a-interferonnal; 58 pacienst daganatindikációval és 17-et vírusos indikációkkal. Egyetlen paciens esetében sem volt a kezelés alatt antitest-stimuláció, jóllehet a kezelés időtartama 15-től egészen 35 hétig terjedt. A találmány szerinti eljárás tette lehetővé először, hogy nagytisztaságú, a natív, monomer interferonra nézve homogén, szilárd, sóktól és pufferalkotórészektől mentes és nem-immunogén a2-interferont állítsunk elő. Az ismert eljárás szerint végzett aminosav-szekvenciaanalízis a következő aminosavszekvenciát adja: 5 10 15 20 25 30 35 Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gin Gin Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gin Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu A következő példák hivatottak a találmány részletesebb szemléltetésére anélkül, hogy annak oltalmi körét bármilyen formában korlátoznák. A találmány szerinti eljárás mindenekelőtt a fermentlé tekintetében tág határok között korlátlanul alkalmazható. így az is lehetséges, hogy más gazdaszervezetek biomasszáját használjuk, amelyek a mechanikus feltárás után hasonló interferon- kitermeléseket adnak, és olyan interferonok, például ai-interferon, esetében is alkalmazzuk, amelyek hasonlóképp specifikusan reagálnak az EBI-1 monoklonális antitesttel. Az a-interferonhoz kevesebb homológiával rendelkező más interferonok is tisztíthatók a találmány szerinti eljárással megfelelő magasan specifikus monoklonális antitest alkalmazása esetén. A jelen találmány tárgya rekombináns a-interferon előállítására szolgáló eljárás, amelyre részletezve az jellemző, hogy: az interferon-gént tartalmazó gazdaszervezetet a szokásos körülmények között tenyésztjük; a sejteket szokásos növekedési idő után elöljük, és összegyűjtjük; a kifejezett interferont szokásos módon elválasztjuk; 50 55 60 7
