202883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-interferon előállítására és tisztítására
1 HU 202 883 B 2 A sejttörmeléket enyhén lúgos közegben elkülönítjük; az interferont töményítjük, és tandem-kromatográfia segítségével előtisztítjuk; az eluátum pH-ját a szennyezések elválasztása céljából 4,0-4,8- ra állítjuk be; az interferont egy kationcserélő oszlopon eluálószerként valamilyen illékony puffert használva kromatográfiával végtisztítjuk, és utána liofílizáljuk; gazdaszervezetként E. coli-t használunk; a sejteket elöljük bizonyos növekedési idő után, mely alatt 20%-nál kevesebb, előnyösen 5%-nál kevesebb, különösen előnyösen 1%- nál kevesebb metionin-interferon képződik; a sejteket homogenizátorban 2 pH-n feltárjuk, és az interferont elválasztjuk; tandem-kromatográfíát végzünk egy cellulóz-előoszlopból és egy affinitás-oszlopból álló rendszeren úgy, hogy a tisztítandó anyagot átmossuk valamilyen alkalmas mosóoldattal mindkét oszlopon, és végül az a-interferont az affinitás- oszlopról valamilyen alkalmas eluálószerrel eluáljuk; az előoszolopot DE-52 cellulózzal, az affinitás-oszlopot valamilyen hordozóhoz kötött monoklonális anti-interferon IgG antitesttel töltjük, és a tisztítandó anyagot mindkét oszlopon 7,5 pH-jú TRIS-NaCl-pufferral átmossuk, és utána az a-interferont az affinitásoszlopról 25%-os etilénglikollal készített 0,1 mólos 5 citromsavoldattal eluáljuk; EBI 1 monoklonális antitestet használunk; a szennyezések elválasztására használt tandem-kromatográfia eluátumának pH-ját 4,5-re állítjuk; a végső tisztításhoz egy MONO-S, Typ HR 10/10 kationcserélőt használunk; az elúcióra 0,1-1,0 mólos, előnyösen 0,1-0,5 mólos ammónium-acetát pufferból 4,0-5,0 pH-n, előnyösen 4,5 pH-n készített lineáris koncentrációgradienst használunk; szilárd a-interferont állítunk elő; nem-immunogén a-interferont állítunk elő; olyan rekombináns, homogén, tiszta a-interferont állítunk elő, amely 5%-nál kevesebb metionin-interferont tartalmaz, amely az interferon redukált formáitól és töredékeitől mentes, amely 0,2%-nál kevesebb oligomert és 2%-nál kevesebb dimer/trimer/tetramert tartalmaz, és amelynek monomertartalma 90%-nál több natív-monomer interferon; a humán-a-interferonhoz használt gazdaszervezet a 10 15 20 Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg He Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met ne Gin Gin lie Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu "tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val He Gin Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser He Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg lie Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu aminosavszekvenciát kódoló gént tartalmazza; a Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg lie Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met lie Gin Gin lie Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu TVr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val He Gin Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser He Leu Ala Val Arg Lys iyr Phe Gin Arg lie Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu aminosavszekvenciájú rekombináns, homogén, tiszta humán- a-interferon 5%-nál kevesebb metionin-interferont tartalmaz, mentes az a-interferon redukált formái- 55 tói és töredékeitől, 0,2%-nál kevesebb oligomert és 2%nál kevesebb dimer/trimer/tetramert tartalmaz, és a natív monomer a-interferonban az 1 és 98 és a 29 és 138 helyzetben lévő ciszteinek között egy-egy diszulfidhíd van. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti eljárások valamelyikével előállítható rekombináns a-interferonok, amelyekre az jellemző, hogy: homogén, tiszta formában 20%-nál kevesebb, előnyösen 5%-nál kevesebb, különösen előnyösen 1%-nál kevesebb metionin-interferont tartalmaznak; ! homogén, tiszta formában redukált formáktól és töre-i dékektől mentesek, és 0,2%-nál kevesebb oligomert és 60 2%-nál kevesebb dimer/trimer/tetramert tartalmaznak; 8
