202883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-interferon előállítására és tisztítására
1 HU 202 883 B 2 derítjük, és mintákat veszünk a proteinmeghatározáshoz és az interferon-teszthez. Az olyan polipeptidek, mint az interferon mechanikus behatások esetén fellépő nyíróerőkkel szembeni ismert érzékenysége [Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 146, 249-253 (1974)] ellenére ezzel az eljárással ilyen pH- körülmények között meglepően magas kitermelések érhetők el nyersinterferonra. A különböző fermentlevek vizsgálata azt mutatta, hogy az elegy összetétele a fermentációs körülményektől függően változott. Különösen az 1. komponens, a metionin-a-interferon, egy alig elválasztható komponens részaránya változott a fermentáció időtartamával: metionin-a-interferon csak 8-9 óra fermentációs időtartam után képződött. A fermentáció kellő időben történő félbeszakításával tehát olyan interferonkészítmények kaphatók, amelyek metionin-interferont nem tartalmaznak. A derített nyerslébe keverés közben 65%-os telítettségig szilárd ammónium-szulfátot adagolunk. Az ammónium-szulfát tökéletes feloldódása után a levet lehűtve éjszakán keresztül állni hagyjuk, a keletkezett csapadékot elválasztjuk, és további feldolgozásig -20 °C-on tároljuk. A tiszta felülúszóból ismét mintákat veszünk az interferon-teszthez, hogy az interferon lecsapását ellenőrizzük. A felülúszóban az interferon 5%-ánál többnek nem szabad maradnia. Az ammónium-szulfátos csapadékot 0,01 mólos nátrium-klorid oldatban oldjuk, a pH-értéket nátriumhidroxiddal 7,5-re állítjuk, és az oldatot 2 óra hosszat keverjük. Az oldatlan részt elválasztjuk, és esetleg mégegyszer extraháljuk 0,01 mólos nátrium-klorid oldattal. Az egyesített tiszta oldatokat egy steril, pirogénmentes dializálópatron segítségével 0,01 mólos nátrium-klorid oldattal szemben dializáljuk. Az interferon oldat ozmolaritásának [Am. J. Physiol., 190, 139 (1934); Am. J. Med., 233, 392 (1957)] 2-3-szori váltás után körülbelül 390-430 mOsmol/l-nek kell lennie. A tisztított oldatból aliquotokat veszünk az interferonteszthez. További tisztításra a „tandem-kromatográfiát” használjuk: ez egy cellulóz-előoszlopból és egy utána kapcsolt nagyspecifitású, monoklonális antitestekkel töltött affinitáskromatográfiás oszlopból álló kombináció. Az előoszlop, egy ioncserélő oszlop arra szolgál, hogy a nehezen oldódó mintarészeket távoltartsa az antitestoszloptól. Az előoszlop készítéséhez DE-52-Zellulose-t (a Whatman cég gyártmánya) 7,5 pH-jú TRIS/NaCl-pufferral jól elkeverünk, és egy kromatográfiás oszlopba töltjük. Az adszorbenst addig mosuk a pufferral, amíg az eluátum már nem mutat pH- és ozmolaritásváltozást. Az előoszlophoz egy gramm biomasszára számolva 0,5-1,0 g DE-52-Zellulose-t használunk 0,025 mólos TRIS/HC1 és 0,2 mólos nátrium-klorid pufferban; mindenegyes tisztításhoz újonnan készítjük. Az antitest-oszlop céljaira egérascitesből kinyert és tisztított monoklonális anti-interferon-IgG-t kötünk bróm-ciánnal aktivált Sepharose 4B (a Pharmacia cég terméke) hodozóhoz. A kész oszloptöltő anyagot nátrium-azidot tartalmazó foszfátpufferolt nátrium-klorid oldatban (PBS) jégszekrényben tároljuk. Az első használat előtt vagy hosszabb tárolás után az antitest-oszlopot 25%-os etilén-glikollal készült 0,1 mólos citromsavoldattal mossuk, hogy esetleges oldódó részeket eltávolítsunk, és végül foszfátpufferolt nátrium-klorid oldattal semlegesre mossuk. Egy gramm biomasszára számítva az antitest-oszlop esetében 0,2-1,0 ml oszloptérfogat szükséges: az oszlop többször használható. A dializált interferonoldatot ezután átpumpáljuk mindkét oszlopon (előoszlopon és antitest-oszlopon), és az eluátumot 280 nm-en való extinkcióméréssel ellenőrizzük. Az interferonoldat felvitele után addig mosunk 7,5 pH-jú TRIS/NaCl-pufferral, amíg a proteinmenynyiség az eluátumban a csúcsérték 1/20-ára csökken. Annak ellenőrzésére, hogy az interferon felkötött-e az antitestoszlopra, az eluátumot megvizsgáljuk interferontartalomra. Utána az antitest-oszlopot elválasztjuk az előószloptól, és egyedül addig mossuk 7,5 pH-jú TRIS/NaCl- pufferral, amíg az eluátumban már nem mutatható ki protein. Az antitestekhez kötött interferon elúciója 25%-os etilénglikollal készített 0,1 mólos citromsav oldattal történik, miközben az eluátum extinkcióját 280 nm-en követjük. Az interferont tartalmazó proteincsúcsot összegyűjtjük. Az interferonoldatot a végső tisztításig -20 °C-on tároljuk. Az interferon-teszt, proteinmeghatározás és a fordított fázisú HPLC-ranalízis azt mutatja, hogy ezzel a tisztítással 60-90%-os tisztaságú ainterferont kapunk. Ez az interferonoldat oligomer formák mellett szabad SH-csoportokkal rendelkező redukált formákat, dimereket, trimereket, tetramereket és a nem-natív monomert tartalmazza. Ezek a komponensek biológiailag és immunológiailag mind interferonként jellemezhetők. Meglepő módon ezeknek a komponenseknek egyrésze a 4,5 pH-n (ammóniával) végzett lecsapással eltávolítható. Eközben különösen a redukált kénhidakkal rendelkező komponensek, tehát a szabad SH-csoportokat tartalmazó formák (5. és 6. komponensek) redukálódnak. Ennek a csapadéknak az analízise azt mutatja, hogy monomer interferont csak csekély mennyiségben ragad magával. Végső tisztításra a Pharmacia cég egy MONO-S- oszloppal, Type HR HV10 (kationcserélő) töltettel ellátott FPLC-készülékét használjuk, amely 60 mg-ig terjedő mennyiségű proteinnel termelhető. Ez az ioncserélő, és nagy előnye, hogy a tisztítandó protein viszonylag nagy mennyisége ellenére a végső tisztítás csak néhány óra hosszat tart, a pufferoldatok sterilre szűrten használhatók, és szobahőmérsékleten lehet dolgozni. A lecsapás után kapott tiszta felülúszót felvisszük az oszlopra. Különös fontosságú az FPLC-elválasztásnál használt puffer. Ennek az interferonkomponenseket jelentősen elválóan kell eluálni, és utána tökéletesen eltávolíthatónak kell lennie. Ezeknek a tulajdonságoknak a felhasznált ammóium-acetát puffer felel meg, amellyel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60' 6
