202883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-interferon előállítására és tisztítására
1 HU 202 883 B 2 A találmány tárgyát képezik továbbá különböző fajok leírt olyan rekombináns a-interferonjai, amelyek alkalmazás után az illető fajokban nem stimulálnak antitesteket, valamint éppígy a szilárd interferonok is. Előnyös egy az előbb leírt tulajdonságokkal rendelke ző rekombináns humán-a-interferon, főként egy a Cys Asp Leu Met Leu Leu Lys Asp Arg Gin Phe Gin Gin Gin Ile Trp Asp Glu Gin Leu Asn Thr Glu Thr Lys Tyr Phe Ser Pro Cys Phe Ser Leu Pro Gin Thr Ala Gin Met Arg Asp Phe Lys Ala Glu Phe Asn Leu Thr Leu Leu Asp Leu Glu Pro Leu Met Gin Arg Ile Ala Trp Glu Ser Thr Asn 5 His Ser Leu Arg Arg Ile Gly Phe Pro Thr Ile Pro Phe Ser Thr Asp Lys Phe Ala Cys Val Lys Glu Asp Thr Leu Tyr Val Val Arg Leu Gin Glu Gly Ser Arg Ser Leu Phe Gin Glu Glu Val Leu His Lys Asp Ser Tyr Thr Glu Ile Gin Gly Ser Ile Leu Leu Lys Glu Ala Glu Ile Ser Leu Arg Arg Thr Leu Ser Cys Leu Phe Gly Asn Glu Met Ile Ser Ala Ala Leu TVr Gin Val Gly Val Ala Val Arg Lys Lys Tyr Met Arg Ser Ser Lys Glu aminosavszekvenciának megfelelő rekombináns humán-a-interferon. Különösen előnyös egy rekombináns, nem-immunogén, szilárd humán-a-interferon, amely a Cys Asp Leu Met Leu Leu Lys Asp Arg Gin Phe Gin Gin Gin Ile Trp Asp Glu Gin Leu Asn Thr Glu Thr Lys Tyr Phe Ser Pro Cys Phe Ser Leu Pro Gin Thr Ala Gin Met Arg Asp Phe Lys Ala Glu Phe Asn Leu Thr Leu Leu Asp Leu Glu Pro Leu Met Gin Arg Ile Ala Trp Glu Ser Thr Asn 20 His Ser Leu Arg Arg Ile Gly Phe Pro Thr Ile Pro Phe Ser Thr Asp Lys Phe Ala Cys Val Lys Glu Asp Thr Leu Tyr Val Val Arg Leu Gin Glu Gly Ser Arg Ser Leu Phe Gin Glu Glu Val Leu His Lys Asp Ser Tyr Thr Glu Ile Gin Gly Ser Ile Leu Leu Lys Glu Ala Glu Ile Ser Leu Arg Arg Thr Leu Ser Cys Leu Phe Gly Asn Glu Met Be Ser Ala Ala Leu Tyr Gin Val Gly Val Ala Val Arg Lys Lys Tyr Met Arg Ser Ser Lys Glu aminosavszekvenciának felel meg, és homogén, tiszta formában van, 5%-nál kevesebb metionin-interferont tartalmaz, mentes az interferon redukált formáitól és 35 töredékeitől, 0,2%-nál kevesebb oligomert és 2%-nál kevesebb dimer/trimer/tetramert tartalmaz, és a monomertartalom több, mint 95%-a az 1 és 98 és a 29 és 138 helyzetű ciszteinek között egy-egy diszulfidhidat tartalmazó natív monomer a-interferon. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi a szennyezések és az interferon-melléktermékek legkíméletesebb körülmények között való elválasztását. Ezt a Cys Asp Leu Met Leu Leu Lys Asp Arg Gin Phe Gin Gin Gin Ile Trp Asp Glu Gin Leu Asn Thr Glu Thr Lys Tyr Phe Ser Pro Cys Phe Ser Leu Pro Gin Thr Ala Gin Met Arg Asp Phe Lys Ala Glu Phe Asn Leu Thr Leu Leu Asp Leu Glu Pro Leu Met Gin Arg Ile Ala Trp Glu Ser Thr Asn His Ser Leu Arg Arg Ile Gly Phe Pro Thr Ile Pro Phe Ser Thr Asp Lys Phe Ala Cys Val Lys Glu Asp Thr Leu Tyr Val Val Arg Leu Gin Glu Gly Ser Arg Ser Leu Phe Gin Glu Glu Val Leu His Lys Asp Ser Tyr Thr Glu Ile Gin Gly Ser Ile Leu Leu Lys Glu Ala Glu Ile Ser Leu Arg Arg Thr Leu Ser Cys Leu Phe Gly Asn Glu Met Ile Ser Ala Ala Leu Tyr Gin Val Gly Val Ala Val Arg Lys Lys iyr Met Arg Ser Ser Lys Glu aminosavszekvenciának megfelelő a2Arg-interferon példáján mutatjuk be részletesebben, de ha szükséges, akkor a találmány lényegét nem érintő csekély módosításokkal más a-interferonok is előállíthatók és tisztíthatók a találmány szerinti eljárással. A savval lecsapott gyorsfagyasztott biomasszát 1%os ecetsavoldatban keverve felengedjük. Ezt és az öszes következő műveletet körülbelül 5 ‘C-on hajtjuk végre. A proteinnek a sejtekből való extrakciója, amint a 34 32 196.9 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentésben kimerítően leírják, a bakteriumsejtek valamilyen homogenizátorban való feltárásával, valamilyen lecsapószer, például PEI-600 polietilénimin 0,1^0,25% koncentrációban való hozzáadásával, a pH-érték nátrium-hidroxid segítségével 7,5- 10,0-re való állításával, és a szuszpenzió több óra hoszszat végzett keverésével történik. Végül a pH-értéket 7,5-ra állítjuk, a nyerskivonatot kíméletes módon de-55 60 5
