202883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-interferon előállítására és tisztítására
1 HU 202 883 B 2 Víz (semleges pH-jú) 950 ml. A sejteket folytonos sejtvonalként kezeljük. A tenyésztáptalajban tripszinizációval és hígítással szélesztjük. A meghatározáshoz a sejteket hemocitométerben megszámoljuk, és meghatározó táptalajban szuszpendáljuk, hogy csészénként 4-5x104 sejt/ml-es oltóoldatot kapjunk; ezt elosztjuk a lemezeken. Az inkubálást 5% szén-dioxidot tartalmazó és 80% nedvességtartalmú atmoszférában végezzük 37 °C-on. Az egysejtréteg 8-24 óra múlva gyakorlatilag teljes lesz. Erre az időpontra külön képcsövekben előkészítünk interferont és a szérumhígításokat. Az ellenőrző lemezhez 1:1000, 1:2000.....1:32000 HS-11 hígításokat 37 °C-on 1 óra hosszat inkubálunk. A mintalemezhez a szérummintákat 1:2, 1:4, 1:8........1:64 arányban hígítjuk egy hígítótáptalajjal, amely annyi HS-ll-et tartalmaz, hogy minden üvegben 10 I.E. HS-ll/ml végkoncentrációt kapunk, és 37 °C-on szintúgy 1 óra hosszat inkubálunk. A lemezeket dekantáljuk, minden egyes csészécskét 100 pl hígítótáptalajjal (2., 3., 10. és 11. sor) vagy 100 pl hígítással (4-9. sorok) töltünk meg. A lemezeket 37 °C-on 4 óra hosszat inkubáljuk az előbbiekhez hasonlóan. Utána a lemezekre csészécskénként 100 pl vírustáptalajt (vírus nélkül) és 50 pl vírus hígítást (3., 11., 4-9. sor) rétegezünk, hogy 36 órán belül közel 90%-os citopatikus hatást érjünk el, és újból inkubáljuk. 24 óra elteltével és mikroszkópiás ellenőrzés után a sejteket metilibolyával megfestjük. Az eredményeket a 12.a)-12.f) ábrákon a mellékletben mutatjuk be. METODIKA. Az analízishez a következő eljárásokat használjuk: Proteinmeghatározás. BIORAD proteinmeghatározás: Ez a meghatározás a Coomassie Brilliant Blue színezéket használja, és protein-színezék-komplexet 595 nm-en méri. Az alkalmazott standard marha- szérumalbumin. Planimetriás meghatározás: Agélpermeációs-HPLC- nél jelentkező csúcsfelületeket 214 nm-nél mérjük. Az átszámítás a marha-szérumalbumin, ovalbumin, tripszinogén és lizozim hitelesítő anyagokból egy faktor segítségével történik. Ezt a meghatározást mindenekelőtt a tandem-kromatográfiás tisztítási fokozat, a 4,5 pH-n végzett kicsapás és a MONO-S oszlopon végzett FPLC után végezzük kiegészítésként vagy kizárólagosan. Interferonmeghatározás. A CELLTECH (Nagy-Britannia) cégtől beszerezhető, humán alfa- interferon meghatározására szolgáló „NK2-IRMA”-t használjuk. Standardként egy „HS 11” laborstandard szolgál, amelyet egy biológiai meghatározás (WISH-sejtek és Vesicular Stomatitis Vírus plakk-redukciós tesztje) segítségével állítottunk be a B 69/19 nemzetközi standardra. SDS-gélelektroforézis. LAEMMLI módszerét [Nature 227, 680 (1980)] használjuk. A proteinek megfestésére használt színezék Coomassie Brilliant Blue. Az interferon-készítmények tisztaságellenőrzésénél mindig 20 mikrogrammot használtunk. Kromatofókuszálás. Bodo és Adolf módszerét („Separation and Characterization of Human IFN-alpha Subtypes”, „The Biology of the Interferon System”, 113-118 old., Elsevier 1983, E. DeMaeyer and H. Schellekens kiadás) alkalmazzuk, amelynél egy MONO-P kromatofókuszáló oszlopot HR 5/20 (Pharmacia) használunk 4-7 pH tartományban. A pufferok a megadott 25% 1,2-propándiol adalék helyett 25% acetonitrilt tartalmaznak az átfolyási sebesség megnövelése céljából. A protein koncentráció regisztrálása 280 nm-en történik, a pH-regisztrálás automatikus. Az analizálandó mintákat liofilizáljuk, vízben 1 mg/ml töménységű oldatot készítünk, és utána 5 térfogat A puffénál (pH 7,1) hígítjuk. Egy- egy analízishez 0,2-1,0 mg interferont használunk. Gélpeimeációs HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia). Stacioner fázis: WATERS 1-125; 2x (300 mmx7,8 mm); 10 pm részecskemátmérő. Mozgó fázis: 0,5 mólos nátrium-szulfát, 0,02 mólos dinátrium-hidrogén-foszfát, nátriumhidroxiddal 7,0 pH-ra állítva. 0,04% Tween 20, 25% propilénglikol. Átfolyási sebesség: 0,5 ml/perc Detektálás: UV-abszorpció 214 nm-en. Molekulatömeg-kalibrálás: Borjú szérumalbumin M 66000 Ovalbumin M 45000 Tripszinogén M 24000 Lizozim M 14300 Fordított fázisú HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia). Stacioner fázis: Bakerbond WP Cl8; 250mmx4,6 mm; 5 pm részecskeátmérő; 30 nm pórusátmérő. Mozgó fázis: A: 0,1%-os vizes trifluor-ecetsavoldat, 2,2 pH; B: 0,1%-os acetonitriles trifluor-ecetsavoldat. Gradiensprogram: 0-2 perc: 45% B 2-32 perc: 45-53% B 32-40 perc: 53% B 40-50 perc: 45% B Átfolyási sebesség: 1 ml/perc Detektálás: UV-abszorpció 214 nm-es. A mellékletek jegyzéke: 1. ábra: A tandem-kromatográfia utáni savas eluátum fordított fázisú HPLC-kromatogramja; a K1-K7 komponensek ábrázolása. 2. ábra: A tandem-kromatográfia utáni savas eluátum gélpermeációs HPLC-kromatogramja. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 t 60 12
