202872. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dimer indol-alkaloid-keverék, katarantin és vindolin szétválasztására és kinyerésére alkaloid-keverékből
1 HU 202 872 A 2 fokkal és gazdaságosan egymás mellett izolálhatjuk az egyes monomer (vindolin, katarantin) és dimer előnyösen vinblasztin) alkaloidokat, az összes alkaloidot tartalmazó sűrítményből vagy száraz maradékból. A találmányunk szerinti eljárás részleteit az alábbi példákkal szemléltetjük: 1. példa a kísérleteket egy 380 mg/kg vinblasztin-, 500 mg/kg katarantin- és 1200 mg/kg vindolin-tartalmú drogból végezzük. Megjegyezzük, hogy ez a magas hatóanyagtartalom csak a kiemelkedő minőségű (többnyire Madagaszkárban termett) drogokban fordul elő. Az eljárás 1. és 2. lépése a 201549 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás alapján végezhető el. 1. lépés: extrakció Katarantusz drogból (melynek vinblasztin-tartalma: 380 mg/kg, katarantin-tartalma: 500 mg/kg, vindolintartalma: 1200 mg/kg) 1-1 kg őrleményt szobahőmérsékleten háromszor 3 órán át 7-7 liter 1% borkősavat tartalmazó vízzel ellenáramban, szakaszosan, extraháljuk a feldolgozást az egyensúlyi kivonatból végezzük. Az egyensúlyi kivonat 7 literét (amely megfelel 1 kg drognak) egyszer 2 liter, majd négyszer 1 liter kloroformmal extraháljuk. Az egyesített 6 liter kloroformos kivonatokat vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, a szárítószert kiszűrjük. 2. lépés: száraz maradék készítése Az oldathoz 50 ml etanolt adunk, majd 40 ‘C-os fürdőről csökkentett nyomáson kloroformmentesre pároljuk. A maradék etanolos oldathoz 30 ml benzolt adunk, majd csökkentett nyomáson, 40 *C-on szárazra pároljuk. 8,2 g barna, porszerű száraz-maradékot kapunk. [Vinblasztin-tartalom: 350 mg (92%), katarantin-tartalom: 465 mg (93%), vindolin-tartalom: 1140 mg (95%).] Analitika: mind a kiindulási termék, mind a kapott termék analitikai vizsgálatát HPLC-módszerrel végezzük el, majd standardokkal hasonlítjuk össze. Az adatokban szereplő alkaloidok az alább megadott kromatográfiás rendszerben [mely egyébként megegyezik az Egyesült Államok Gyógyszerkönyvének (USP XXI). Vinblastine Sulfate c. cikkelyének (2453. oldal) a vinblasztin tisztaságát vizsgáló és megkövetelő HPLC-s módszerével] egymástól jól elválaszthatók és referenc standard-anyagokkal szemben nagy pontossággal mérhetők. Az eljárás kivételezését Isco (USA) gyártmányú 2 pumpás HPLC- berendezésen végezzük. Oszloponként Lichrosorb RP-18 5 mikron szemcsézetű töltetet, eluensként pedig A és B oldat 28:72 arányú elegyét használjuk. A oldat: 14 ml dietilamin + 986 ml víz elegyét H3P04-el pH-7,5 értéke állítjuk. B oldat: 200 ml acetonitril + 300 ml metanol elegye. A detektor hullámhosszát 262 nm-re állítjuk be. A terméket eluensben oldva közvetlenül injektáljuk a készülékbe. A kapott eredményekből a bemérés és hígítások figyelembe vételével számítható ki a kiindulási anyag és kapott termék egyes komponenseinek menynyisége. 3. lépés: dimer-alkaloid-szulfáuképzés A 2. lépésben kapott 8,2 g szárazmaradékot 50 ml etanolban oldjuk, majd 1,5 ml ecetsavat adunk hozzá, Ezután 5%-os kénsavas etanollal Stuphan-indikátorpapír mellett 4,2-4,5-re állítjuk a pH-értékét. A dimer indol-alkaloidok leválasztását 48 órán át, szobahőmérsékleten végezzük. A kivált kristályokat szűrjük, etanollal mossuk, megszárítjuk. Termék: 0,945 g dimer indol-alkaloid-szulfát-elegy, melynek VLB-tartalma 35%, azaz 331 mg (88%). A kapott termékből ismert módon (például a 193 398 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerint) eljárva 290 mg gyógyszerkönyvi minőségű vinblasztinszulfát nyerhető. Az anyaglúgban a monomerek bomlás nélkül megtalálhatók. (495 mg katarantin és 1190 mg vindolin.) 4. lépés: szulfát-képzés anyaglúgjának feldolgozása- katarantin izolálás A 3. lépésben kapott 75 ml etanolos, savas alkaloid-oldatot háromszoros térfogatára számított vízzel hígítjuk és háromszor 100 ml benzollal kirázzuk. Az egyesített benzolos részeket háromszor 50 ml 2%-os borkősavval extraháljuk. Az egyesített vizes-borkősavat és vizes-etanolos fázisokhoz a 3. lépésben ismertetett és a szulfátleválasztáshoz felhasznált kénsavval ekvivalens mennyiségű ammónium-hidroxidot adunk (az oldat pH-értéke így 4 alatt marad), majd egyszer 100 ml és háromszor 50 ml kloroformmal extraháljuk. Az egyesített kloroformos oldatot szárítjuk, csökkentett nyomáson, legfeljebb 40 *C-on, 20-25 ml-re sűrítjük be és egy 50 ml-es szilikagéllel töltött kromatografáló oszlopra visszük fel. A kromatografáló oszlop üvegből készült, alul csappal ellátott cső, melynek nagysága 20 cm, átmérője 2,5 cm. 30 g Merck gyártmányú, 50—150 mesth szemcseméret-tartományú szilikagélt kloroformmal nedvesítve töltünk az oszlopba. Ezután a fenti kloroformos oldat felöntése után 100 ml kloroform folyamatos adagolásával az anyag-oldatát a szilikagélen eloszlatjuk. Ezután az oszlopot etil-acetát:ecetsav 19:1 arányú elegyével kezdjük eluálni, 40-50 ml-es frakciókat gyűjtve, melyeket vékonyrétegkromatográfiával ellenőrzünk. Először a katarantin- tartalmú frakciók eluálódnak egyéb hasonló jellegű alkaloidokkal és különböző színező anyagokkal. A katarantin teljes kioldása után (erről vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal győződtünk meg!) az eluciót tiszta etil-acetáttal folytatjuk és újabb 2-3 frakció után megjelenik az ellenőrző kromatogrammon a vindolin foltja. Az eluciót a vindolin teljes Ieoldása után befejezzük. A frakciók ellenőrzését az alábbi vékonyrétegkromatográfiás rendszerrel végezzük: Merck 5554/uv 254 - Kieselgel-lemez, futtató: etil-acetát: benzol: meta-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
