202761. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabilizált eritropoietin-készítmények előállítására
HU 202761B A találmány tárgya eljárás fiziológiailag közömbös, tárolható eritropietin-készítmények előállítására, amelyek eritropoietint, fiziológiásán elviselhető puffert, valamint — kívánt esetben komplexképzőt, izotóniát beállító szert, kalcium-kloridot és egyéb, injekciós célokra szokásos anyagokat — tartalmaznak. Az eritropoietin (EPO) egy olyan glikoprotein, amely stimulálja a csontvelőben a hemoglobin, illetve az eritrociták képződését; főként a vesében keletkezik, a szérumban kis mennyiségben található, és fiziológiás körülmények között részben a vizeletben választódik ki. Az EPO veseelégtelenség esetén fellépő hiánya veseanémiával jár. Ilyen esetekben EPO fiziológiás, azaz néhány mikrogrammnyi mennyiségben egy vagy több adagban való beadásával az eritrociták képződése ismét megindítható. Mivel a szervezet már csekély dózisváltozásokra érzékenyen reagál, az adagolásnak pontosan reprodukálhatónak kell lennie. Rendszerint vizes oldatként intramuszkulárisan vagy intravénásán injektálva, vagy az orrnyálkahártyán át spray formájában alkalmazzuk az EPO-t. Ismeretes azonban, hogy az EPO, mégpedig mind az eddig humán vizeletből nyert termék [Miyake és munkatársai, J. Bioi. Chem. Vol. 25. 5558-5564 (1977)], mind az időközben géntechnológiai úton előállított termékek (8502610 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés) vizes oldatban nem stabilak, és már magában -80 ’C-on végzett tárolás során is nagy aktivitásveszteségek lépnek fel. Ez a két termék némileg különbözik egymástól a glikozid-részben és az aktivitásban, a szérumban található EPO- val végzett közvetlen összehasonlítás eddig nem ismeretes. Ezek az aktivitásveszteségek eyrészt azEPO-nak a tárolásra szolgáló ampullák felületének katalitikus hatásai, nehézfémnyomok, levegő oxigénje, stb. által kiváltott bomlására, másrészt viszont az EPO- molekulának az edényfalra való lerakódására vezetendők vissza, amikor szintén részleges denaturálódás léphet fel. Mivel, mint fentebb említettük, mindegyik adagolási egység csak néhány mikrogramm anyagot tartalmaz, az adszorpció által okozott veszteségek már rövid tárolási idő után is jelentékenyek lehetnek. A 178 576 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben ezért leírják, hogy az edényfalra való üyen lerakódást polimer vegyületek, így humán vagy marha szérumalbumin, lecitin, dextrán, cellulóz, polietilénglikol stb. hozzáadásával gátolják, és ezáltal körülbelül 2 óra hosszat 20 °C-on való tárolás után az EPO 75-98%-os újra kimutathatóságát érik el az üyen adalék nélkül elérhető csupán 16%-kal szemben. Az újbóli visszamérés azonban csak radioaktív jelzés (4C) alapján történik, úgyhogy ezek a kísérletek semmit sem mondanak az EPO bomlás elleni stabilizálásáról. Észleleteink szerint üyen szerekkel hosszú ideig tartó stabüizálás nem érhető el, azaz az EPO hatásossága egér-tesztben erősen csökken, emellett ezek a szerek az injekciónál immunogén reakciókat idézhetnek elő. A 1 178 665 számú nyilvánosságra hozott euró1 pai szabadalmi bejelentésből ismeretesek további „stabüizátorok”, különösen fagyasztva szárított EPO-készítmények részére. A polimer anyagok, PEG 4000, zselatin és dextrán 40 mellett különböző cukrokat és cukoralkoholokat, aminosavakat, szervetlen sókat és tiolvegyületeket említenek. Ezen anyagok humán szérumalbuminnal, zselatinnal és dextránnal való kombinációit is említik. Ugyanebben a közleményben is a fagyasztva szárított termék 2 hónapos tárolása után az újbóli visszamérést csak a radioaktivitás alapján végzik el. Ezt 87-99%-nak adják meg, az adalék nélküli 60%-kal szemben. Mivel a közvetlenül a gyártás utáni liofüizált anyagot használják standardként, így nincs megadva, hogy a készítmény előállításakor mekkorák az aktivitási veszteségek. Ezek a készítmények is nagy hatékonyság-csökkenést mutatnak egér-tesztben. Innen adódott tehát az a feladat, hogy egy olyan jól elviselhető EPO készítményt találjunk, amely stabüan tárolható, azaz megőrzi in vivo hatásosságát, nem adszorbeálódik az ampulla- vagy fecskendőfalra, és könnyen injektálható formában hozható. Ezt a feladatot különböző komponenseknek az igénypontokban közelebbről ismertetett kombinációjával oldottuk meg, éspedig úgy, hogy először 5- 50 g/liter karbamidot, 1-50 g/liter aminosavat és 0,05-5 g/liter nemionogén nedvesítőszert tartalmazó oldatot készítünk, ehhez az oldathoz 6,5-7,4 pH- érték beállítására 20-100 mmól/liter koncentrációban foszfát puffert, 0,01-5 g/liter koncentrációban kalcium-kloridot és 0,5-10 g/liter koncentrációban nátrium-kloridot adunk, majd dózis egységenként hozzákeverünk 100-1,000,000 egység eritropoietint. A stabilizálás szempontjából döntő a karbamid és különböző aminosavak hozzáadása. A karbamidot 5-50 g/1, előnyösen 10-15 g/1 mennyiségben használjuk adalékként. Aminosavakként például az L-izoleucint, glicint, L-alanint, L-arginint, L-leucint, L-fenüalanint, L-glutaminsavat vagy L-treonint említhetjük. A különböző aminosavak keverékei különösen előnyös hatásúaknak látszanak. Ezeket 0,5-50 g/liter, előnyösen 1-20 g/liter mennyiségben használjuk, az összmennyiségének előnyösen 5-25 g/l-nek kell lennie. Szükség van továbbá valamüyen fiziológiásán elviselhető pufferra, amely az injekciós oldatok esetében szükséges kis koncentrációban (körülbelül 20-100 mmól/1) az EPO részére szükséges 6,5-7,4, különösen 7,0-7,2 pH-tartományt beállítja. Foszfátpufferokon kívül többek között glicinát, karbonát, citrát is használható, ahol ellenionokként nátriumionokon kívül kálium- vagy ammóniumionok is számításba jöhetnek. Pufferhatást biztosítanak ezenkívül még a készítményben levő aminosavak is. Az EPO-nak az ampulla- és fecskendőfalon való megkötődését jelentősen visszaszoríthatjuk valamüyen detergens csekély mennyiségének hozzáadásával. Mivel a készítményt túlnyomórészt injekcióként keü használni, ennek az anyagnak fiziológiásán, de főleg intravénásán elviselhetőnek kell lennie. A 0,05-5 g/1, főként a 0,1 -0,5 g/1 közötti koncentrációk váltak be. Ilyen célra nemionogén nedvesítőszerek, így például a különböző Polymacrogol-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
