202709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herbicid szerekkel szemben rezisztens kultúrnövények előállítására és védelmére
HU 202709B A találmány aminosav-bioszintézist gátló herbicid szerekkel szemben rezisztens kultúrnövények előállítására alkalmas eljárásra vonatkozik. Ismert, hogy éretlen embrióból nyert kalluszkultúrából (növényi sebszövet-tenyészetből) a kuloricanövény regenerálható [Green C.E., Philips R.L.: Crop. Sei. 15,417 (1975); és 160 390, valamint 177 738 számú európai szabadalmi leírások]. Ez azonban csak kevés genotípus - például az A188, W64, fekete mexikói édes beltenyészeti vonalak - estén sikerült. Csak a tápközegek fejlesztése tette lehetővé, hogy számos különböző beltenyészeti vonalból morfogén és embriogén kalluszkultúrát lehessen nyerni [Duncan és munkatársai. Planta 165, 322 (1985)]. Ennek fontos feltétele, hogy a tápközeghez aminosavakat kell adni. A mután és variáns sejtvonalak szelektálására azok a sejtkultúrák alkalmasak, amelyekből hónapok vagy akár évek múlva is regenerálható az érintetlen növény. Ha például a tápközeghez vagy herbicid vegyületet adnak toxikus dózisban, csak kevés kallusz-szektor éli túl, és ezekből regenerálható a herbicid szerrel szemben rezisztens növény. Ha a kallusz-szövetet mutagénnel kezelik, megnövekedik a mután-hozam (4 443 971 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Azok a herbicid szerek, amelyek az aminosavak bioszintézisében szerepet játszó enzimeket gátolják, a sejttenyészetekre csak gyenge herbicid hatást fejtenek ki, ha a tápközeg aminosavakat tartalmazza, amelyek bioszintézisét az adott herbicid gátolja. Ezért tehát aminosavak jelenlétében - vagyis éppen azon körülmények között, ahogy eddig a regenerálható kukoricakalluszt legelőnyösebben létrehozták és továbbtenyésztették - igen nehéz ugyanakkor olyan mutánsokat találni, amelyek az aminosav-bioszintézist gátló inhibitorokkal szemben rezisztensek. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy kultúrnövények regenerálható sejtvonalai olyan tápközegekben is tenyészthetők, amelyek nem tartalmaznak aminosavat. Az ebből a sejtvonalból származó kultúrnövények regenerálása is kivitelezhető ugyanebben a tápközegben. Ez különösen váratlan volt, mivel az aminosavak a kalluszkultúrák, illetve növények regenerálásához és fejlődéséhez lényegesek. Az ilyen kultúrák kalluszkultúrák, illetve növények herbicid-rezisztens sejtvonalainak szelektivitására alkalmazhatók. A találmány tárgya tehát eljárás aminosavak bioszintézisét gátló szerekkel szemben rezisztens kultúrnövények előállítására, oly módon, hogy a. szelektáljuk azokat a kalluszkultúrákat, illetve sejtszuszpenzió-kultúrákat, amelyek aminosavmentes tápközegben embriogén és morfogén sajátságaik megtartásával növekednek, b. az így kapott kultúrákat aminosavmentes, inhibitort tartalmazó tápközegben tenyésztjük, és szelektáljuk azokat a kultúrákat, amelyekből az érintetlen növény regenerálható. A találmányt közelebbről az alábbiakban ismertetjük, különös tekintettel az előnyös megvalósítási formákra. Az alább ismertetett találmány szerinti eljárással előállíthatok a kultúrnövények, előnyösen egy1 szikű kultúrnövények, különösen gabonafélék regenerálható, herbicid-rezisztens sejtvonalai. Különösen előnyösen kukorica-sejtvonal alkalmazható. A herbicid-rezisztens sejtkultúra szelektálására elsősorban olyan sej tvonalat kell találni, amely aminosavmentes tápközegben megfelelő mértékben képes szaporodni, és ezenkívül a növény regenerálhatósága nagy gyakorisággal indukálható. Ezért a kalluszkultúrákat aminosavmentes tápközegben, például módosított Murashige-Skoog (MS) tápközegben [Physiol. Plant 15,473 (1962)], vagy módosított Nó-tápközegben [Chu C.C. és munkatársai: Sei. Sin. 16,659 (1975)] tenyésztjük. A fenti tápközegek lényegében egy szénforrást - például szacharózt, glükózt, maltózt és raffinózt -, egy nitrogénforrást - például ammóniumsót vagy nitrátot -, valamint ismert módon vitaminokat, hormonokat és ásványi sókat tartalmaznak. Az alkalmazott tápközeghez előnyösen egy vagy több olyan fiziológiásán elfogadható szerves savat vagy annak sóját adhatunk, amely kultúra szaporádását elősegíti, ilyen savak például a citrát-ciklus savjai, így citromsav, almasav, oxál-ecetsav, borostyánkősav és piroszőlősav vagy ezek sói. A só előnyösen nátrium- vagy káliumsó, különösen előnyösen ammóniumsó lehet. A fenti adalékok elősegítik a kallusz- és sejtszuszpenzió-kultúrák szaporádását aminosavmentes tápközegben, és lehetővé teszik standard tenyésztési körülmények között a tenyészetek átoltását még hosszabb időn - legalább 1-2 éven - keresztül is, a növény vegyületeket az aminosavak helyettesítésére adhatjuk a tápközeghez, előnyösen kb. 0,1-10 mmól/1 különösen előnyösen 0,5-2 mmól/1 koncentrációban. Standard tenyésztési körülmények alatt a szakemberek által szokásosan alkalmazott körülményeket értjük, a tenyésztést kb. 15-35 °C hőmérsékleten, előnyösen 20-30 °C-on végezzük, megvilágítással, vagy anélkül. Az átoltási intervallum szokásos módon kb. 10- 30 nap, előnyösen 14-21 nap, ami természetesen a tenyészet növekedésétől függ. Az aminosavmentes tápközegben szaporodni képes sejtvonalakat ezután az inhibitor-rezisztens, különösen herbicid-rezisztens kallusztkultúrák és sejtszuszpenzió-kultúrák szelektálására alkalmazzuk. A fenti tenyészetekkel alapjában véve minden inhibitorral szemben szelektálhatunk, előnyösen azonban az aminosav-bioszintézist gátló inhibitorokkal szemben végezzük a szelektálást. A fenti csoporton belül előnyösen az (I) általános képletű herbicidekkel - a képletben R* jelentése hidroxilcsopor t vagy metilcsoport, Rz jelentése hidroxilcsoport, metilcsoport vagy etücsoport, Rá jelentése amino-metilén-csoport, hidroximetilén-csoport vagy karbonilcsoport, R^ jelentése hidroxilcsoport vagy (a) általános képletű csoport, ahol x értéke 1-5, előnyösen 1-2 lehet, és n értéke 0-4, előnyösen 0-2 - szemben rezisztens sejtvonalakra szelektálunk. Különösen előnyösen glufozináttal (fiszfino-tricinnel), illetve szerkezeti analógjaival, például a bialafosz-szal, valamint dimetil-foszfinil-hidroxiecetsawal szemben rezisztens sejtvonalakra végez2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
