202709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herbicid szerekkel szemben rezisztens kultúrnövények előállítására és védelmére
HU202709B zük a szelektálást. Ha az adott inhibitor optikailag aktív izomer formájában létezhet, a vegyidet racemát ját és biológiailag aktív enantiomerjét is alkalmazhatjuk a szelektálásra. A szelekciónál jobb hozamok elérésére a választott sejtvonalat mutagenizálhatjuk is ismert eljárásokkal. A mutagenizálást vagy kémiai szerekkel - például etil-metánszulfonáttal vagy N-metil-N-nitrozo-guanidinnal (MNG) - végzett kezeléssel, vagy besugárzással - például Röntgen- vagy ultraibolyasugarakkal - hajthatjuk végre. A fenti mutagéneket olyan koncentrációban alkalmazzuk, amely koncentrációban a sejtek 30-70%-a elpusztul. Az inhibitor-rezisztens sejtszuszpenzió-kultúrák, előnyösen kalluszkultúrák tulajdonképpeni szelektálása a már kiválasztott, aminosavmentes tápközegben történik, amelyhez hozzáadjuk az inhibitort. Az inhibotor koncentrációja tág határok között változhat, és lényegében úgy választjuk azt meg, hogy a kalluszok 70-99%-a, előnyösen 96- 99%-a elpusztuljon a választott koncentráció mellett. A szelekciót azonos, vagy növekvő inhibitorkoncentráció alkalmazásával többször megismételhetjük. A rezisztens sejtek, ületve regenerálódni képes kalluszok szelekciójának hozamát növelhetjük, ha a tápközeget a fent említett, fiziológiásán elfogadható szerves savakkal vagy azok sóival kiegészítjük. A szelekció élességét ezenkívül úgy is fokozhatjuk, hogy a kaduszkultúrát fényben - kb. 8-16 órán keresztül 500-5000 lux alkalmazása mellett - tenyésztjük. Egyébként a tenyésztést szokásos módon, egy vagy több passzálással, előnyösen 2-4 passzálással végezzük, és mind agaros, mind folyékony tápközeget alkalmazhatunk. Az átoltási intervallum a szaporodás sebességétől függően változik, általában 1-5 hét, előnyösen 3-4 hét lehet. Különösen a rezisztens, morfogén kalluszok és sejtszuszpenziók ismételt átoltásával kaphatunk olyan sejtvonalakat, amelyek 5 mmól/1 koncentrációig elviselik a herbicid szereket, és még a növény regenerálására is képesek. A találmány szerinti eljárás segítségével természetesen olyan sejtszuszpenzió-kultúrák és regenerálódásra képes kalluszkultúrák is szelektálhatok, amelyek két, eltérő hatáshelyű herbiciddel szemben rezisztensek. A herbicidekkel szemben rezisztens növények regenerálását ismert eljárásokkal végezzük, olyen tápközegekben, amelyek ugyanazt a herbicidet tartalmazzák, amellyel szemben a szelektálást végeztük. Bizonyos körülmények között azonban előnyösen olyan tápközegben végezzük a regenerálást, amely nem tartalmaz herbicidet. A találmány így olyan herbicid szerekkel szemben rezisztens kultúrnövényekre is vonatkozik, amelyek a fent ismertetett tenyésztési eljárásokkal állíthatók elő, továbbá a fenti növények alkalmazására más genotípusokkal való keresztezésre. A fenti kultúrnövény előnyösen egyszikű kultúrnövény, még előnyösebben gabonaféle, különösen előnyösen kukoricanövény. A keresztezés segítségével például olyan hibrideket is előállíthatunk, amelyek egy vagy két herbiciddel szemben rezisztensek. Ezt úgy érhetjük el, hogy 3 egy herbicid-rezisztens növényt egy nem rezisztens beltenyészeti vonallal keresztezünk, illetve két olyan herbicid-rezisztens növényt keresztezünk, amelyek különböző hatáshelyű herbicidekkel szemben lettek szelektálva. Az üyen keresztezési eljárásokat is ismert módszerekkel végezhetjük. Herbicid-rezisztens növény alatt olyan növényt értünk, amely a herbicid gyomirtásra használt mennyiségének kétszeresét képes elviselni, károsodási tünetek nélkül. A találmány tárgya továbbá eljárás kultúrnövények védelmére, amelynek során a gyomot a herbiciddel szelektíven irtjuk olyan vetési területen, amelyet a találmány szerinti eljárással kapott, herbiciddel szemben rezisztens növénnyel vetettünk be. Herbicidként előnyösen olyan vegyületet alkalmazunk, amely az aminosav-bioszintézist gátolja, különösen egy fent megadott (I) általános képletű vegyületet. Különösen előnyösen glufozinátot, illetve szerkezeti analógjait, például di- és tripeptideket, valamint dimetil-foszfinil-hidroxi-ecetsavat használunk. Ha az alkalmazott herbicid optikailag aktív formában létezhet, mind a racemátot, mind az egyes optikailag aktív izomereket használhatjuk. A herbicidet, illetve herbicidek elegyeit ismert módon visszük fel a vetési területre, lehetőleg bizonyos idővel, előnyösen kb. 10-100 nappal a kultúrnövény ültetése után, amíg a gyomnövény fejlődése el van nyomva. A találmányt közelebbről az alábbi példával kívánjuk ismertetni. Példa Morfogén kukorica-sejtkultúra létrehozása aminosavmentes tápközegben B73, W64A, A 188 beltenyészeti vonalú éretlen kukoricamagból (a fenti fajták hibridjeit is használhatjuk) a nőivarú virág beporzása után 10-14 nappal kipreparálhatjuk a fiatal embriókat. Az előnyösen 1-1,5 mm hosszúságú embriókat steril körülmények között kalluszindukáló tápközegbe visszük, és 25 ± 2 °C-on sötétben tenyésztjük. Kalluszindukáló tápközegként Murashige és Skoog-féle módosított tápközeget (MS) vagy módosított N6-tápközeget használhatunk - amelyek összetételét az 1. táblázatban ismertetjük -, 1500 mg/1 prolin, 500 mg/1 aszparagin, 500 mg/1 glutamin, 500 mg/1 vitaminmentes kazein-hidrolizátum és 60 g/1 szacharóz hozzáadása mellett. A tápközeghez 0,7% agart adunk, és a pH-értéket autoklávozás előtt kálium-hidroxiddal 5,8 -ra állítjuk. A vitaminokat sterilre szűrjük, és a lehűtött tápközeghez adjuk. 2-3 hét alatt kialakul a kalluszkultúra, amely alkalmas a primordia-sarjak és szomatikus embriók képzésére. Végül a fenti kalluszkultúrát aminosavmentes A ésB tápkczegben tenyésztjük. 1500 embrióból kiindulva 5 sejtvonalat találtunk, amely a fenti tápközegekben több, mint egy éven keresztül szaporodni tud, a regenerálódóképesség megtartása mellett. Az átoltásokat 15-28 naponta végezzük. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
