202652. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neopterin és kreatinin meghatározására humán biológiai mintákból diagnisztikai céllal
1 HU 202 652 B 2 A találmány tárgya eljárás neopterin és kreatinin arány és mennyiség meghatározására humán biológiai mintákból előkezelés nélkül vagy mintaelőkészítéssel, rétegkromatográfiás elválasztással, és az azt követő mennyiségi kiértékeléssel. A találmány tárgyát képező eljárás értelmében úgy járunk el, hogy a mintát megfelelő mennyiségben standardokkal együtt rétegkromatográfiás lapra visszük föl, a lapot kifejlesztjük és az elválasztott komponenseket ismert módon megmérjük fényabszorbciójuk, illetve fluoreszcenciájuk alapján. Esetünkben a minta lehet előkezeletlen vizelet, vagy célszerűen megválasztott mintaelőkészítési (pl. hígítás, szűrés, centrifugálás, extrakció stb.) módszerrel kezeit vizelet vagy plazma. A standardokra kapott értékekből kalibrációs görbét készítünk és a minták neopterin és kreatinin tartalmát ebből számítjuk. A neopterin szint testnedvekben, illetve vizelet esetében a neopterin/kreatinin arány igen fontos jellemző adat, többek között az AIDS, rosszindulatú daganatos megbetegedések (Cancer, Vol. 55 1052-1055 1985), vírusinfekciók és a transzplantált szervek kilökődésének diagnosztikájában (Transplantation, Vol. 36 650-653 1983). Több eljárás (HPLC, RIA: J. Chrom. Vol. 227 61 1982, Anal. Biochem. Vol. 141 472-480 1984) is ismert neopterin és kreatinin meghatározására humán vizeletből, illetve szérumból [Biochem & Clin. Aspects of Pteridines, Vol. 3 195-210 (1984), Anal, Biochem. Vol. 141 472-480 1984], A meghatározást nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) elválasztással kombinált ultraibolya (UV) abszorbeiós és fluoreszcenciás (J. Chrom. Vol. 227 61 1982), vagy UV és elektrokémiai (EC) detektálással valósítják meg (J. Chrom. Vol. 343 35—41 1985). A radioimmunoassay (RIA) módszer a neopterin (Anal. Biochem. Vol. 141 472-480. 1984), a klasszikus pikrinsavas módszer valamely változata a kreatinin meghatározására alkalmas (pl. J. Clin, Chem. Clin. Biochem., Vol. 12 344-9 1974). A fenti meghatározási módszereknek különböző hátrányai ismertek. A RIA alapvetően nem szelektív, időigényes és drága, a két anyagot különböző bemérésekből határozza meg, így a kreatinin meghatározásban elkövetett hiba a szokásos neopterin: kreatinin [)iM/M] mérőszám kiszámítását jelentősen befolyásolja. A HPLC módszer esetében a meghatározás azonos mintából történik. Az elválasztáshoz igen drága gradiens HPLCV berendezés szükséges, az eljárás mintaelőkészítést vagy bonyolult oszlopkapcsolást igényel (Biochem. & Clin. Aspects of Pteridines, Vol. 3 195-210 1984), a mérési ciklus hosszú - a minden mérés után rutinszerűen szükséges oszlopregenerálások miatt, és kb. 10-20 minta után még hosszabb regenerálási idő szükséges. A detektáláshoz két detektor és két adatfeldolgozó-csatorna, valamint rutin analízishez célszerűen automata mintaadagoló szükséges. Ezzel folyamatosan óránként 4-6 minta analízise végezhető el vizelet esetében, szérumnál esetenként kevesebb. Célunk volt olyan módszer kidolgozása, amely a kromatográfiás elválasztás és a szelektív, érzékeny detektálás megvalósítása mellett alkalmas nagyszámú minta klinikai laboratóriumi analízisére, ugyanakkor gazdaságos, nem igényli nagy műszer beruházást, napi anyagigénye megfelel a hazai viszonyok között alkalmazott klinikai analitikai rutinnak és pontossága a klinikai diagnosztikai igényeket kielégíti. A fenti módszerek hátrányait kiküszöbölendő, azon felismerésünk alapján, hogy a neopterin és a kreatinin a biológiai minták, például a vizelet, többi komponensétől rétegkromatográfiás úton is elválasztható, kidolgoztuk rétegkromatorgáfiás módszerünket, nagyszámú vizeletminta gyors, megbízható elemzése céljából úgy, hogy a két vegyületet egy mintafelvitelből határozzuk meg, a mintaelőkészítés szükségtelen vagy minimális legyen, a műveletek a mintákon párhuzamosan folytathatóak legyenek. A szérum vagy más bonyolultabb mátrixok esetében a mintaelőkészítést nem lehet elhagyni, de megfelelő módszereket alkalmazva, pl. alkohollal történő hígítás és centrifugálás, a rétegkromatográfiás eljárás további előnyeit hasznosítani lehet. A találmány tárgyát képező eljárás előnyének tekinthető a rétegkromatográfiás eljárások azon előnye, hogy a minta felvitele, elválasztása és kvantitatív értékelése térben és időben elválasztható. A HPLC módszerhez képest a rétegkromatográfiás eljárás eszközigénye jelentősen kisebb, a berendezés egyszerűbb, az egy mintára jutó felhasznált oldószer mennyisége, továbbá a mintaelőkészítés munka- és anyagigénye kisebb. A rétegkromatográfiás eljárás mintakapacitása nagyobb, az egy mintára jutó idő rövidebb, így a módszer számos szempontból gazdaságosabb. Az egyszerű rétegkromatográfiás meghatározást alkalmazó módszerek ellen megnyilvánul bizonyos szakmai előítélet anilitikus körökben. Ez a megállapítás érvényes a neopterin és kreatinin szint és arány meghatározás esetében is. Az okok között jelentős szerepe van a műszerezettség, időnként indokolaüan, fetisizálásának, továbbá annak is, hogy sokkal több cég foglalkozik HPLC és RIA rendszerek árusításával mint ahány TLC rendszerek árusításával. Ennek megfelelően nagyobb a konkurrencia, viszont az alapberendezések (fotométer, leolvasó stb.) több helyen megtalálhatóak. A réteglapokat gyártó cégek később jelentek meg a kémiailag kötött állófázisokkal, mint a kromatográfiás oszlopgyártó cégek a kémiailag kötött fázisú oszlopokkal, és manapság az elválasztások 70-80 százalékát ilyen állófázisokon valósítják meg. A műszeres rétegkromatográfia elterjedése ellen hat a szakterület utóbbi öt-tíz évben végbement jelentős fejlődésének nem kellő propagandája és ismerete. A pontosság, az alkalmazási lehetőségek bővülése és az automatizálás terén a műszeres rétegkromatográfiában jelentős előrelépés történt. A szabadalomban leírt eljárás során a technika jelenlegi állásának alkalmazása elegendő volt, mivel pontosság, reprodukálhatóság és gyorsaság szempontjából a mai automatikus mintafelvétel, ellenőrzött kifejlesztés és számítógépes kiértékelés teljesítőképessége elegendő a kívánt cél eléréséhez. A módszer szelektivitása az oszlopkromatográfiás módszerével azonos, a detektálás ugyanúgy más-más elv alapján történik, a szelektivitást a specifikus detektorok biztosítják (UV és fluoreszcencia). Az Rf értékek különbsége 0,66 egység a rétegkromatográfiás meghatározásnál, a retenciós idők különbsége 0,2 oszlop holttérfogat (to) az oszlopkromatográfiás módszernél, (J. Chrom, vol. 227 61 1982). Az eljárást visszanyeréses kísérletekkel is vizsgáltuk, a normál értéknek, illetve ennek négyszeresének megfelelő mennyiségű neopterint használva és 99 ± 3,5%-os értékeket kaptunk. A RIA módszerhez képest a rétegkromatográfiás el5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
