202652. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neopterin és kreatinin meghatározására humán biológiai mintákból diagnisztikai céllal
3 HU 202 652 B 4 járás gyorsabb, jelentősen kisebb a munka- és reagensigénye, és nincs szükség sem ellenanyag(ok)ra sem radioaktív anyagok használatára. Szintén előnyös az azonos mintából azonos körülmények között történő meghatározás, mivel a bemérések hibája a számítások során kiküszöbölődik. A találmány szerinti rétegkromatográfiás neopterin és kreatinin meghatározási eljárásban úgy járunk el, hogy a mintát, mely lehet előkezeletlen vizelet, vagy mintaelőkészítésen (pl. hígítás, szűrés, centrífugálás, extrakció stb.) átesett vizelet, plazma vagy egyéb testnedv, megfelelő mennyiségben rétegkromatográfiás lapra visszük föl, melléjük standardokat teszünk kalibrációnak, állófázisként kémiailag módosított állófázisú (szilikagél alapú) réteglapokat használhatunk, mint pl. amino vagy C18. A megfelelő oldószerkeverékkel (mint pl. amino réteg: dioxán vagy más ciklikus éter típusú szerves oldószer és 17%-os vizes ammónia oldat elegye, C)8 típusú réteg: acetonitril és káliumkloridot tartalmazó vizes foszfátpuffer elegye) a lapot kifejlesztjük, klaszszikus felszálló, vízszintes vagy kényszeráramoltatott pl. túlnyomásos kifejlesztési módszerrel. Az elválasztott komponenseket ultraibolya fénnyel megvilágítva az abszorbeióként jelentkező kreatinint, illetve a fluoreszkáló neopterin foltokat szubjektív módon félkvantitatív célokra, vagy kvantitatív célokra, objektív módon, spektrofotometriás módszerrel, leoldás után küvettában vagy a lapon spektrodenzitométerrel mérve, a standardokra kapott értékekből kalibrációs görbét készítve és a minták neopterin, illetve kreatinin tartalmát a kalibrációkból számítjuk. Példák: 1. A meghatározás egy előnyös megvalósítási módja például: Merck #15647 típusú amino módosítási réteglapra a lap széleit az OPLC módszernek megfelelően impregnálva, a lap aljától 1,5 cm-re a szélektől 1,5 cm-re egy sorban, 0,5 cm-enként felvisszük randomizált sorrendben a mintákat és a kalibrációs oldatokat, a mintákból az előkísérletek alapján megállapítva 0,05-1,0 mikroliter vizeletet, a kalibrációs sorok oldatait 200 ni menynyiségben. A kifejlesztést 1,4-dioxán és 6M vizes ammónia oldat 8 : 2 térfogatarányú elegyével hajtjuk végre. A lap megszárítása után denzitométerrel a kreatinint 238 nm-en, ultraibolya fényabszorbeióként mérjük reflexiós üzemmódban, a neopterint 400 nm fölötti fluoreszcens fény emissziójának mérésével határozzuk meg, 366 nm gerjesztési hullámhosszat alkalmazva, reflexiós módban. Az eredményeket a kalibráció alapján, ismert módon lineáris regresszióval, a legkisebb négyzetek módszere segítségével értékeljük ki. 2. A meghatározás egy másik előnyös megvalósítási módja ha az első példában leírtaknak megfelelően járunk el azzal a különbséggel, hogy a lap széleit nem impregnáljuk és kapilláris erők hatásával, felszálló, esetleg vízszintes irányú kifejlesztést alkalmazunk. 3. A meghatározás egy másik előnyös megvalósítási módja ha az első példában leírtaknak megfelelően járunk el azzal a különbséggel, hogy Macherey-Nagel vagy Merck ClgW réteglapot, kifcjlesztőszerként acetonitril és 0,1% káliumkloridot tartalmazó 6,4-es pH-jú foszfátpuffer 8 : 2 térfogatarányú elegyét alkalmazzuk. 4. A meghatározás egy másik előnyös megvalósítási módja ha a harmadik példában leírtaknak megfelelően járunk el azzal a különbséggel, hogy a lap széleit nem impregnáljuk és kapilláris erők hatásával, felszálló, esetleg vízszintes irányú kifejlesztést alkalmazunk. 5. A meghatározás egy további előnyös megvalósítási módja ha az első, illetve a harmadik példában leírtaknak megfelelően járunk el azzal a különbséggel, hogy a lap széleit csak a futásiránnyal párhuzamosan impregnáljuk, a mintákat és a kalibrációs oldatokat a középvonal két oldalán attól mindkét irányban 0,6-1,0 cm-re visszük föl és két irányban fejlesztünk ki egy időben. 6. Az 1-5. példákban leírtak szerinti meghatározási módok bármelyike, ahol a minta előkezeletlen vizelet. 7. Az 1-5. példákban leírtak szerinti meghatározási módok bármelyike, ahol a minta előkezelt vizelet 8. Az 1-5. példákban leírtak szerinti meghatározási módok bármelyike, ahol a minta előkezelt szérum. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás neopterin és kreatinin arány és mennyiség meghatározására humán biológiai mintákból, azzal jellemezve, hogy: a) a felhasználásra kerülő kémiailag módosított rétegkromatográfiás lapot előkészítjük, majd aktiváljuk, ezt követően b) a kalibrációs standardokat és a mintát ismert módon Hamilton fecskendővel, vagy precíziós mintafelvivővel a rétegkromatográfiás lapra felvisszük, azután c) a komponenseket ismert módon kromatográfiásan elválasztjuk, majd d) a rétegkromatográfiás lapot megszárítjuk, melyet követően e) az ultraibolya fényabszorpció mérése alapján a kreatinin, ultraibolya fénnyel való megvilágítás hatására kibocsátott fluoreszcens fény mérése alapján a neopterin mennyiségét a kalibrációk segítségével meghatározzuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy réteglapként amino módosítású réteglapot, eluensként gyűrűs éter és 6 mólos amónia oldat, előnyösen 70-90 térfogatszázalék gyűrűs éter, 30-10 térfogatszázalék 6 mólos ammónia oldat elegyét alkalmazzuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy réteglapként Cu azaz oktadccilszilán módosítású réteglapot, eluensként acetonitril és vizes foszfátpufferoldat elegyét alkalmazzuk, előnyösen a puffer pH-ja 5 és 7 között van, tartalmaz 0,1% káliumkloridot és az acetonitril aránya 70-90 térfogatszázalék a maradék 30-10 térfogatszázalék a vizes-sós puffer. 4. Az 1-3. igénypontok bámelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintaként vizeletet viszünk előkezelés nélkül a réteglapra. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintaként vizeletet viszünk a réteglapra hígítás és/vagy szűrés és/vagy centrífugálás után. 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintaként szérumot vagy más testnedvet viszünk a réteglapra extrakció és/vagy bepárlás és/vagy hígítás és/vagy szűrés és/vagy centrífugálás után. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
