202596. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-aciloxi-biciklo [3.3.0] oktán-7-on-2-karbonsav-észterek recemát-hasítására sztereospecifikus enzimes vagy mikrobiológiai acilát-hidrolízissel
9 HU 202 596 B 10 mólos foszfát-pufferben. Hozzáadunk 750 mg marhapankreászból származó a-kimotripszint (Chemical Dynamics Corporation cég), és Ultra-Turrax-szal homogenizáljuk. Utána a reakcióelegyet 28 °C-on körkörös rázógépen addig rázatjuk, amíg a bevitt észter-acilát szubsztrát 50%-ig átalakul. Ezután az elegyet többször extraháljuk metil-izobutil-ketonnal, az egyesített extraktumokat vákuumban szárazra bepároljuk, és a nem természetes konfigurációjú, jelen esetben lehidrolizált enantiomer elválasztása céljából szilikagéllel töltött oszlopon diklór-metán diklór-metán/5% aceton oldószergradiensel eluálva kromatografáljuk. Az 1. frakció tartalmazza az abszolút konfigurációban a PGI2 természetes prosztaciklinnek megfelelő, elhidrolizálatlanul maradt (+)-II általános képletű enantiomert. Szárazra párlás után 115 mg (+)-3<x-acetoxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] oktdn-2ß-karbonsav-metil-észtert kapunk. [a] d = +2,6° (c = 1,035; kloroform) fajlagos forgatású nem kristályosodó olajként. Az elhidrolizálatlanul maradt (+)-II általános képletű enantiomer kémiai úton végrehajtott acilát-hidrolízise a 3. példa szerinti terméket eredményezi. 5. példa A4, példában leírtaknak megfelelő körülmények között 300 mg (±)-3a-acetoxi-7,7-etiléndioxi-cisz-biciklo [3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-metil-észtert (2 képlet) reagáltatunk 7 pH-jú foszfátpufferban 750 mg Bacillus subtilisből származó szubtilizinnel (Boehringer Mannheim cég). Az elegyet 28°C-on 10 óra hosszat való rázás után metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, az extraktumot szárazra bepároljuk, és szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Diklór-metán diklór-metán/4% aceton oldószergradienssel első frakcióként az elhidrolizálatlan, a természetes prosztaciklinnek megfelelő konfigurációjú (+)-enantiomert eluáljuk. A frakció szárazra párlása után 130 mg (+)-3a-acetoxi-7,7-etiléndioxi-cisz-biciklo [3.3.0] -oktän-2ß-karbonsav-metil-0sztert kapunk [a] d = +2,4° (c = 1,085; kloroform) fajlagos forgatási értékű olajos folyadékként 100 mg (+)-3a-acetoxi-7,7-etiléndioxi-cisz-biciklo[3.3.0] oktkn-2ß-karbonsav-metil0sztcrt feloldunk 1 ml metanolban, az oldatot hozzáadjuk 250 ml vízmentes, porított kálium-karbonát 2 ml metanollal készített szuszpenziójához és 1 órát kevetjük szobahőmérsékleten. A szilárd részeket kiszűrjük és a szűrlet pH-ját ecetsavval 7,5-re állítjuk be. A metanolt vákuumban ledesztilláljuk és a maradékot megosztjuk etil-acetát és víz között. Az etil-acetátos fázist vízmentes nátriumszulfáttal szárítjuk és vákuumban besűrítjük. 80 mg (+)-7,7-etilén-dioxi-3a-hidroxi-cisz-biciklo [3.3.0] oktin-2ß-karbonsv-metilüsztert kapunk olajos folyadék alakjában, amelynek specifikus forgatóképessége +27,5' (c= 1,0; kloroformban). 6. példa Egy 2 literes Erlenmeyer-lombikot, amely 500 ml autoklávban 120 °C-on 30 percig sterilezett, 0,1% peptonból, 0,2% kukoricalekvárból, 0,5% glükózból és 0,5% élesztőkitonatból álló, 7,5 pH-ra beállított tápoldatot tartalmaz, beoltjuk az Alcaligenes marshallii ATCC 21030 törzs kémcsöves ferdetenyészetével, és 48 óra hosszat körkörös rázógépen rázatjuk. Ebből a szaporítótenyéseztből 300 ml-rel beoltunk egy 10 literes fermentort, amely az előbb a szaporítótenyészetnél megadottal azonos összetételű 5 liter sterilezett táptalajjal van töltve. Silicon SH habzásgátló hozzáadása közben 29 'C-on 5 liter/perc levegőztetés és 220 fordulat/perc keverés mellett tenyésztünk. Egy 36 órás szaporítási szakasz után hozzáadjuk a szubsztrátot 30 g (±)-3a-acetoxi-7,7- -(2,2-dimctil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-metil-0szter (1 képlet) 125 ml etanollal készített, sterilre szűrt oldatát, és a reakció lefutását folyamatosan kivett minták analízisével követjük. A szubsztrát hozzáadása után 10 órával a bevitt szubsztrát 50%-a átalakul. A fermentor tartalmát 4x3 liter metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, az extraktumokat egyesítjük, és vákuumban szárazra pároljuk. A kapott maradékot metanolban oldjuk, és szilikonolaj eltávolítása céljából redős szűrőn szűrjük. A szűrletet vákuumban ismét szárazra pároljuk és a maradékot az elreagálatlan nem természetes konfigurációjú (—)-II általános képletű enantiomer (1. frakció) eltávolítása céljából szilikagéllel töltött oszlopon diklór-metán diklór-metán/20% aceton gradienssel eluálva kromatografáljuk. A 2. frakcióban hexánból végzett kristályosítás után 10,7 g (+)-3a-hidroxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetilén-dioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-metil-ösztert kapunk, amelynek olvadáspontja 63-64 ‘C, az enantiomer-kitermelés az elméleti 81,9%-a. A fajlagos forgatás: [a] d = +26,1° (c = 1,3; kloroform). Az enantiomer-felesleg 97,5%. 7. példa Egy 2 literes Erlenmeyer-lombikot, amely 500 ml autoklávban 120 'C-on 30 percig sterilezett, 3% glükózból, 1% kukoricalekvárból, 0,2% nátrium-nitrátból, 0,1% kálium-dihidrogén-foszfátból, 0,05% magnézium-szulfát-heptahidrátból, 0,002% vas(II)-szulfát-heptahidrátból és 0,05% kálium-kloridból álló táptalajt tartalmaz, beoltunk a Mucor rouxii (ATCC 8097 törzs kémcsöves ferdetenyészetével, és a körkörös rázógépen 30 °C-on 2 és 1/2 napig rázatjuk. Két ilyen szaporítótenyészet tartalmával beoltunk egy 20 literes fermentort, amely az előbb megadott szaporító-tenyészetével azonos összetételű 14 liter 121 °C-on és 1,1 bar túlnyomáson 60 percig sterilezett táptalajjal van töltve. Silicon SH habzásgátló hozzáadása közben 29 °C-on 0,7 bar túlnyomáson 15 liter/perc levegőztetés és 220 fordulat/perc keverés mellett tenyésztünk. Egy 15 órás szaporítási szakasz után a szubsztrátot 9 g (+)-3a-acetoxi-7,7-(2,2-dimctil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo[3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-metil-észter (1 képlet) 220 ml etanollal készített sterilre szűrt oldata formájában adjuk hozzá a tenyészethez, és a reakció lefutását folyamatosan kivett minták analízisével követjük. A szubsztrátbeadagolás után két órával a beadott szubsztrát 50%-a átalakul. A fermentor tartalmát 3x10 liter metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, az extraktumokat egyesítjük és vákuumban szárazra bépároljuk. A kapott maradékot metanolban oldjuk és a szilikonolaj eltávolítása céljából redős szűrőn megszűrjük. A szűrletet vákuumban ismét szárazra pároljuk, és a maradékot az átlakulatlan kiindulási anyag eltávolítása céljából szilikagéllel töltött oszlopon 5 liter diklór-metán 5 liter diklór-metán/10% aceton gradienssel eluálva kromatografáljuk. Ily módon 3,3 g (+)-3a-hidroxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] oktdn-2ß-karbon-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
