202596. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-aciloxi-biciklo [3.3.0] oktán-7-on-2-karbonsav-észterek recemát-hasítására sztereospecifikus enzimes vagy mikrobiológiai acilát-hidrolízissel
3 HU 202 5% B 4 sertésmájból származó, észteráz (Boehringer Mannheim cégtói), sertéspankreászból származó lipáz (Chemical Dynamics Corporation cégtől), Bacillus subtilis eredetű szubtilizin (Boehringer Mannheim cégtől). Ezen enzimek mind oldott, szuszpendált vagy például bróm-ciánnal aktivált Sepharose-hoz vagy oxirán-akrilgyöngyökhöz kötött formában vagy bármilyen más immobilizált formában használhatók. A találmány szerinti eljáráshoz különösen a következő mikroorganizmusok megfelelők: Alcaligenes marshallii ATCC 21030, Mucor rouxii ATCC 8097, Corynebacterium equi ATCC 21107, Trichoderma koningii CBS 85068, Sarcina lutea ATCC 9341, Penicillium citrinum ATCC 8506, Flavobaterium lutescens IFO 3085, Alcaligenes paradoxus ATCC 17713. Felhasználhatók azonban a mikroorganizmusokból izolált enzimek is oldott vagy immobilizált formában. A találmány szerinti eljárással előállítható (+)-I általános képletű optikailag aktív biciklooktán-származékok értékes köztitermékek a gyógyászatiig hatásos prosztaciklinszármazékok szintéziséhez. A sztereospecifikusan hidrolizáló enzimek és mikroorganizmusok többsége a (±)-II általános képletű racém 3a-aciloxicisz-biciklo [3.3.0] oktán-származékokat a PGI2 természetes prosztaciklinnek megfelelő abszolút konfigurációjú (+)-I általános képletű optikailag aktív alkoholokká hidrolizálja. Ez a spektrális és optikai tulajdonságok olyan referenciaanyagokkal való összehasonlítása útján derül ki, amelyek optikailag aktív karbaciklin-analógok szintézisének közbülső lépéseiben szokásosan előállítható. Az így kapott termékek az elhidrolizálatlan (-)-I általános képletű „hamis” enantiomerek elválasztása után közvetlenül felhasználható a PGI2 természetes prosztaciklinnek megfelelő analógok szintéziséhez. Vannak azonban olyan mikroorganizmusok és enzimek, mint például az a-kimotripszin vagy az Alcalase T (proteáz), amelyek a (±)-II általános képletű racemát két komponense közül a „hamis”, nem természetes konfigurációjú enantiomert hidrolizálják (-)-I általános képletű vegyületté. Ebben az esetben a visszamaradó elhidrolizálatlan (+)-ü általános képletű enantiomert használjuk fel a PGI2-analóg karbaciklinek szintézisére. A találmány szerinti eljárást egyébként olyan általánosan ismert eljárási körülmények között hajtjuk végre, amilyeneket általában alkalmaznak enzimes reakciók, illetve mikrobiológiai átalakítások során, és amelyek a példákból is kiderülnek. Az enzimes vagy mikrobiológiai átalakulás menetét folyamatosan vett minták analízisével követjük nyomon. Analízismódszerekként nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) vagy vékonyrétegkromatográfiás gyorsanalízisek a megfeleló. (A Merck/Darmstadt cég szilikagél'lemezei, kifejlesztés dietil-éterrel, előhívás kénsavas etanollal). A reakciót leállítjuk, és az elegyet feldolgozzuk, amikor a bevitt racém szubsztrát 50%-a átalakult A találmány szerinti enzimes vagy mikrobiológiai sztereospecifikus acilát-hidrolízis különösen a (±)-l-ll képletekkel ábrázolt racém prosztaciklin-intermedierek acilát-hidrolízisére alkalmas. A találmány szerinti eljárással előállított (-t-)-I általános képletű optikailag aktív 3a-hidroxi-vegyületekből gyógyászatilag hatásos prosztaciklinek állíthatók elő. Például (+)-I általános képletű vegyületből kiindulva Iloprost hatóanyaghoz jutunk (leírva a 11591 számú európai szabadalmi leírásban). A Mucor rouxii (DSM 3897) és Alcaligenes marshallii (DSM 3900) törzseket 1986.11.11-én letétbe helyeztük a Német Mikroorganizmus-gyűjteményben (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen). A kiindulási vegyületek előállítása: A-l. példa 7.7- (2,2 -Dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] oktán-3-on-2 -karbonsav-metil-ésUer 616 ml dimetifkarbonátban felszuszpendálunk 38,34 g 55-60%-os nátrium-hidridet, és nitrogéngáz alatt felmelegítjük 50 *C-ra, majd hozzáadunk egy kis mennyiséget 49,31 g 3,3-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)cisz-biciklo[3.3.0] oktán-7-on 370 ml dimetil-karbonáttal készített oldatából. A reakciót 2 ml metanol hozzáadásával beindítjuk, majd hozzáadagoljuk a maradó oldatot, és összesen 7,5 óra hosszat keverjük 50 *C-on. Ezután jeges fürdőben lehűtjük, a fölös nátrium-hidridet metanollal elbontjuk, vizet adunk az elegyhez, és ecetsavval semlegesítjük. A terméket diklór-metánnal extraháljuk, vákuumban bepároljuk és a terméket hexánnal megkristályosítjuk. Dy módon 532,44 g 72 ‘C olvadáspontú terméket kapunk. A-2. példa A-módszer: 7.7- (2,2-Dimetil-trimetiléndioxi)-3a-hidroxi-cisz-biciklo-[3.3.0]oklán-2$-karbonsav-metil-észter 52,0 g 7,7-(2,2-Dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo[3.3.0] oktán-3-on-2-karbonsav-metil-észtert melegítés közben feloldunk 1000ml metanolban, és után lehűtjük az oldatot -40 *C-ra. Ekkor beadagolunk 20,91 g nátrium-bórhidridet, 30 pácig keverjük, majd lassan 171 ml acetonnal elegyítjük és további 1 óra múlva ecetsavval semlegesítjük. Az oldószer nagyrészének ledesztillálása után a maradékot vízzel és diklór-metánnal elegyítjük, extrakció után az elválasztott szerves fázist nátrium-szulfáttal szárítjuk és vákuuban bepároljuk. A maradékot 550 ml metanollal oldjuk, hozzáadunk 9,94 g nátrium-metanolátot, és 105 pácig 40 *C-on melegítjük. Utána jeges fürdőben lehűtjük, semlegesítjük, és az előbb leírtakhoz hasonlóan dolgozzuk fel. A kapott nyerstermóet szilikagélen diklór-metán/etilacetát elegyekkel kromatografáljuk. így 47 g kívánt vegyületet kapunk, amely hexánnal megkristályosodik és olvadáspontja 43 *C. B-módszer: 5,6 g 7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] oktán-3-on-2-karbonsav-metil-észtert oldunk 300 ml etil-acetátban, és 5,1 g platina-dioxid hozzáadása után 22 'C-on normál nyomáson hidrogénezzük, amíg a hidrogénfelvétel befejeződik. Utána kiszűrjük a katalizátort és az oldatot vákuumban bepároljuk. így 56,8 g kívánt vegyületet kapunk, amelynek tisztasága kristályosodó észter készítéséhez megfelelő. A terméket hexánból kristályosíthatjuk és így 44,4 első kristályos terméket kapunk, amelynek olvadáspontja 43 *C. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 % 3
