202594. lajstromszámú szabadalom • Eljárás leukokinek hozamának fokozására
1 HU 202 594 B 2 A találmány tárgya eljárás leukokinek fokozott menynyiségű előállítására oly módon, hogy az indukció és a termelés különböző pH- és/vagy hőmérsékleti értékek mellett történik. A leukokinek fontos szerepet játszanak az élő szervezetek sejtjei, szövetei közötti kapcsolatban, működésük szabályozásában. A „leukokin” fogalom jelentése kiterjed minden olyan biológai aktivitással rendelkező molekulára, vagy molekulacsoportra, melyeket fehérvérsejtek állítanak elő és adott esetben a környezetükbe választanak ki. Ezek a teljesség igénye nélkül a következők lehetnek: interleukinok, interferonok, lipokortin. A fehérvérsejtek in vitro körülmények között is képesek leukokinek termelésére megfelelő indukáló szerek (például vírusok, lektinek, mitogének, dexametazon, forbol-észterek, ionofórok, szintetikus RNS-ek stb.) hatására. így vannak olyan eljárások, amelyek segítségével ipari méretekben lehet biológiailag aktív természetes anyagokat előállítani, ill. a sejtekkel termeltetni (géntechnológiai eljárások). A leukokinek előállítása „természetes úton” is végezhető a géntechnológiai eljárások mellett. A természetes módszereknél az emberi vagy állati fehérvérsejtekhez induccrcket adnak, és a tápoldatban élő sejtek ezek hatására termelik a leukokineket, és ezek a közegből kinyerhetők. így módszert írtak le lipolkortin előállítására glükokortikoid inducerrel [B. Rothhut et al: FEBS Lett. 219, 169 (1987)], B-sejt stimuláló faktor (IL-4) előállítására PMA inducerrel [Hu-Li, J. et al: J. Exp. Med. 165,157 (1987)], interleukin-2 előállítására ConA inducerrel [Kató K. et al: Biochem, Biophys, Rés, Commun. 127,182 (1985)], alfa-interferon előállítására Sendai-vírus inducerrel [Cantell, K. et al: Methods Enzymol 72, 29 (1981)] stb. A fent ismertetett eljárások közös sajátsága, hogy az indukció (indukciós fázis) és a leukokinek termelése (termelési fázis) azonos körülmények (állandó pH, hőmérséklet, inducer-koncentració) között történik. A találmány célja eljárás kidolgozása nem osztódó, szakaszos tenyészetben fenntartou fehérvérsejtek által termelt leukokinek hozamának' fokozására. A leukokinek hozamának fokozására egyik lehetséges út a leukokin-szintézist gátló tényezők hatásának csökkentése, illetve a „feed-back” mechanizmus késleltetése. A találmány alapját az a felismerés képezi, hogy nem osztódó, szakaszos tenyészetben fenntartott fehérvérsejtek esetében a leukokin termelést szabályozó „feedback” mechanizmus késleltethető, ha az indukciót és a termelést nem azonos - az indukció szempontjából optimális - körülmények mellett, hanem a termelést megfelelően megválasztott szuboptimális körülmények között végezzük (lásd 1. ábra). A leukokin bioszintézis exponenciális szakaszát követően felerősödnek azok a biokémiai folyamatok, melyek a szintézis lassulása irányába hatnak (feed-back). A leukokin bioszintézis az exponenciális szakaszt követő lineáris szakasztól kezdve kevésbé érzékeny az inkubálási körülmények megváltoztatására és kevésbé kerül gátlás alá, mint amennyire a szintézist fékező folyamatok gátlódnak. így alkalmas módosítással - a hőmérséklet csökkentésével és/vagy pH-változtatással, valamint a változtatás időpontjának megfelelő megválasztásával - a produkció időtartama jelentős mértékben meghosszabbítható. A találmány szerinti eljárásban az inkubálási körülményeket, így a hőmérsékletet és/vagy pH-t az exponenciális szakaszban megváltoztatjuk, mégpedig csökkentjük, s ezáltal a gátló folyamatok hatása késleltethető és a hozam mintegy kétszeresére növelhető. A fentiek alapján a találmány eljárás interferonok, interleukinok és lipokortin fokozott mennyiségű előállítására buffy-coat tisztításával kapott, nem osztódó, szakaszos tenyészetben fenntartott fehérvérsejtek megfelelő tápoldatban megfelelő inducerrel történő kezelése útján, amely abban áll, hogy az inkubációs pH-t és/vagy hőmérsékletet a leukokinszintézis megindulását követően, annak exponenciális szakaszában csökkentjük. A fent leírt felismerésünk rendszeres, üzemi méretű termelés esetében is igaznak bizonyult, így eljárásunk alkalmazásával jelentős mértékben - mintegy kétszeresére - növelhető a fehérvérsejtek in vitro körülmények közötti leukokin-hozama. A találmány szerinti eljárásban előnyösen úgy járunk el, hogy alfa-inteferon termelés esetén a hőmérsékletet és pH-t is csökkentjük célszerűen 32 “C-ra, illetve 7-es értékre és ezen megváltoztatott körülmények között további 10-20 órán át folytatjuk az inkubálási. Gammainterferon és intcrleukin-2 termelés esetén elegendő a hőmérséklet csökkentése, mégpedig célszerűen 30 "C- ra, függetlenül attól, hogy milyen inducert használunk. Lipokortin termelés esetében célszerűen úgy járunk el, hogy 2 órás indukciós periódus után (37 °C-on) a hőmérsékletet 28 "C-ra csökkentjük és az inkubálást ezen a hőmérsékleten folytatjuk további 15-20 órán át. A fehérvérsejteket a tápoldatból centrifugálással távolijuk el, majd meghatározzuk a felülúszó leukokin-tartalmát. Lipokortin esetén a felülúszó gyulladásgátló hatását határoztuk meg kanragenin ödéma teszten. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy a kapott termékek összetételében változás nem lép fel, állandó minőségű és növelt mennyiségű biológiailag aktív termékek állíthatók elő ipari méretben is. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk. 1. példa Humán leukocita alfa-interferon termelés a Cantell-féle referencia eljárás szerint [Methods Enzymol. 72, 29 (1981)1 A friss emberi vérből származó fehérvérsejtdús frakciót (buffy coat) a szennyező vörösvértestektől többszöri, 0,83%-os ammónium-klorid-oldattal történő hemolízissel megtisztítjuk, majd az így nyert fehérvérsejteket Cantell-féle tápoldatban, amely ásványi sókat és glküzót, valamint gamma-globulinmentes humán szérumot 2,5 mg/ml koncentrációban tartalmaz és pH-ja 7,2-7,4, szuszpendáljuk lxlO7 sejt/ml koncentrációban. A szuszpenzuióhoz 200IU humán leukocita alfa-interferont adunk milliliterenként, majd 37 “C-on 2 órán át inkubáljuk. A sejtekhez 100 HAegység/ml Sendai-vírust adunk és 37 °C-on minimum 20 órán át inkubáljuk. Az inkubálási idő elteltével a tápoldatból a fehérvérsejteket centrifugálással eltávolítjuk. A kapott alfa-interferon termék aktivitása: 9x10* IU/ml W. E. Stewart szerint mérve [The Interferon System, 13. o., Springer- Verlag, Wien, New York (1979)]. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
