202594. lajstromszámú szabadalom • Eljárás leukokinek hozamának fokozására
3 HU 202 594 B 4 2. példa Humán leukocita alfa-interferon termelés fokozása az inkubálási pH és hőmérséklet változtatásával Azonos módon járunk el, mint az 1. példánál, azzal a különbséggel, hogy a Sendai-vírus hozzáadását követő 2. órában a sejtszuszpenziót tartalmazó edényekbe annyi tricin/N-trisz-[hidroxi-metil]-metil-glicin/-puffert (gyártó: Sigma) adagolunk, hogy a pH 7,0 legyen, továbbá a hőmérsiékletet 32 ‘C-ra csökkentjük. (Megjegyzendő, hogy a tricin-puffer az eredeti Cantell-féle eljárásnál is szerepel a tápoldatban.) Az inkubálást ezen megváltoztatott körülmények között további 10-20 órán át folytatjuk. A sejtek elválasztása után a felülúszó 1,8x10s IU/ml alfa-interferont tartalmaz. 3. példa Humán leukocita gamma-interferon és interleukin-2 termelés fokozása az inkubálási hőmérséklet és a pH változtatásával A gamma-IFN és az interleukin-2 egyidejűleg előállítható azonos sejtkultúrában. A termeléshez mind friss buffy coatból nyert, mind az a-IFN termelésben már felhasznált fehérvérsejtek alkalmazhatók. A fehérvérsejt-szuszpenzió előállítása azonos módon történik az 1. példában leírtakkal. A fehérvérsejteket 1 mg/ml humán gammaglobulinmentes szérumot is tartalmazó MSKD-tápoldatban szuszpendáljuk, l-2xl07 sejt/ml koncentrációban. Az MSKD jelű tápoldat összetétele és készítésének leírása a 184 972 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban található meg. Az indukciót 15 pg/ml concanavalin A-val 37 ‘C-on végezzük. Az indukciót közel azonos eredménnyel végezhetjük még 1-10 ng/ml fitohemagglutininnel, vagy 20-100 ng/ml mezereinnel, vagy 0,5-2 |íg/ml A 23187 jelzésű kereskedelmi néven „calcimycin” ionofórral, vagy 5-30 ng/ml forbol-mirisztát-acetát alkalmazásával is. Az inducer hozzáadását követően három óra elteltével a fehérvérsejteket tartalmazó lombikot 30 *C-os termosztátba helyezzük és a pH értékét 7,2-re állítjuk be, majd inkubáljuk. Az inkubációs idő elteltével a sejteket a tápoldatból centrifugálással távolítjuk el. A tápoldat 10 000IU gamma-interferont és 800 IU IL-2-t tartalmaz milliliterenként. 4. példa Lipokortin termelés fokozása az inkubálási hőmérséklet változtatásával Friss emberi vérből származó buffy coat-ot a szennyező vörösvértestektől többszöri 0,83 %-os ammónium-kloridos hemolízissel megtisztítunk, majd az így nyert tiszta fehérvérsejt frakciót 107 sejt/ml koncentrációban szérumot nem tartalmazó tápoldatba szuszpendáljuk, majd 1 pM decametazonnal kezelve 2 órán át 37 "C-on inkubáljuk. Ezt követően az inkubálási hőmérsékletet 28 ‘C-ra csökkentjük. Az inkubálást ezen a hőmérsékleten további 15-20 órán át folytatjuk. Ezután a fehérvérsejteket centrifugálással eltávolítjuk a tápoldatból. Az így nyert felülúszónak, amely egy nyers lipokorün-készítmény, erős karragenin-gyulladásgátló hatása van. A példa szerint eljárva a kapott lipokortin tennék karragenin-teszten mért gyulladásgátló hatása 2-szerese az azonos indukciós és termelési körülmények között nyert lipokortinénak. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás interferonok, interleukinok és lipokortin fokozott mennyiségű előállítására buffy-coat tisztításával kapott, nem osztódó, szakaszos tenyészetben fenntartott fehérvésejtek megfelelő tápoldatban megfelelő inducerrel történő kezelése útján, azzal jellemezve, hogy az inkubációs pH-t és/vagy hőmérsékletet a leukokin szintézis megindulását követően, annak exponenciális szakaszában csökkentjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inkubációs pH-t 7,2 és 6,5 közé és/vagy a hőmérsékletet 15 ‘C - 35 ‘C közé, előnyösen 25 *C - 32'C közé állítjuk be. 5 10 15 20 25 30 35 40 3
