202593. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új citotoxinok és ilyeneket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
7 HU 202 593 B 8 allantois folyadékot adagoltunk hozzá, majd 37 °C hómérsékleten 24 órán át inkubáltuk, a felül úszót centrifugálással elválasztottuk (Mistral, 6 literes centrifuga, 1500 ford/perc), majd 0,22 |im-es szűrőn átszűrtük. A felülúszót anti-limfoblasztoid interferon poliklón antitest immunoaffinitásos (1. példa) oszlopon átengedtük. 10 liter, oszlopról lejövő folyadékot 0,5 literre betöményítünk és egyidejűleg 25 mmólos imidazol-HClval szemben pH = 7,4-nél diaszűrtük Amicon spirálszövet ultraszűrő töltet és YM10 membrán (Amicon Ltd.) alkalmazásával. A betöményített oldatot még tovább dializáltuk 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán át 25 mmólos fenti pufferral szemben, pH = 7,4-nél. A kapott betöményített bLT-tartalmú oldatot ezután két sorbakapcsolt ioncserélő oszlopra adagoltuk: az első 2,5 x 5 cm-es DEAE-Sepharose C1-6B (Pharmacia Ltd.), a második 2,5 cm x 2,5 cm-es CM-Sepharose C1-6B töltetű oszlop. Mindkét oszlopot előzőleg 25 mmólos imidazol-HCl oldattal pH = 7,4-nél 4 *C hőmérsékleten kiegyensúlyoztuk. A DEAE-Sepharose C1-6B oszlopról lejövő folyadékot közvetlenül a CMSepharose töltetű oszlopra adagoltuk. Ezt az oszlopot növekvő koncentrációjú NaCl oldattal (50 mmól, 100 mmől, 250 mmól) eluáltuk 1 ml/perc átfolyási sebességgel, addig, amíg az A^o az alapvonalra visszatért. A fő bLT-tartalmú csúcs 100 mmólos NaCl esetében 30 ml-es mennyiségben jelentkezett A bLT-tartalmú eluátumot közvetlenül 2 cm x 1,6 cm méretű Red-Sepharose CL-6B töltetű oszlopra vittük. A bLT a töltethez kötődött és a tölteten megkötődött bLT-t 50 mmól dietanol-amin - 0,1 mól arginin eleggyel eluáltuk pH = 9,4-nél 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett addig, amíg az A^o érték a bázisvonalra visszatér. A szükséges mennyiség 15 ml. E lépésnél 5-szörös tisztítást értünk el. A Red-Sepharose oszlopról lejövő eluátumot 1 : 4 arányban 50 mmólos dietanol-amin-HCl oldattal hígítottuk, pH = 9,4-nél és Mono Q (Pharmacia Ltd.) töltetű oszlopra adagoltuk, átfolyási sebesség 1 ml/perc. Az összes citotoxikus anyagot visszanyertük a nem kötött frakcióban. A kapott bLT-tartalmú minták aktivitását a tisztítási folyamat alatt az 1. példában leírt LM sejtekkel és semleges vörös festékkel végzett vizsgálattal határoztuk meg és a következő táblázatban foglaljuk össze. Minta Teljes fehérje konc. mg/ml bLT (U/ml) Specifikus aktivitás (U/mg) 1. Anti-lymphoblastoid interferon immunaff. oszlop 0,12 150 1,25 X103 2. CM-Sepharose oszlop 0,085 800 9,4 x 104 3. Red-Sepharose oszlop 0,012 8100 7,2 x 105 4. Mono Q oszlop 0,008 9750 1,2 xlO6 * Bio-Rad fehérjevizsgáló kittel meghat. (Bio-Rad Labor. Richmond, California, USA) Az aminosav vizsgálatok elvégzéséhez a bLT-t egy további tisztításnak vetettük alá, amelyhez fordított fázisú kromatográfiás oszlopot (Pro RPC, Pharmacia Ltd.) alkalmaztunk. A mintát közvetlenül a Mono Q oszlopról erre az oszlopra adtuk fel, és az eluálást 0-15-40% gradiensű acetonitril 0,1% trifluor-ecetsavval készült oldatával végeztük. Az átfolyási sebesség 0,7 ml/perc. Az első 15%-os acetonitril koncentráció növelést 5%/perc sebességgel végeztük, majda 15%-os koncentrációt 5 percig tartottuk, majd ezután a gradienst 1%/perc sebességgel változtattuk. A bLT mennyiségét ELIS A-val mutattuk ki az Aj» csúcsnál, az elúciós görbét az 1. ábrán mutatjuk be. A maximális mennyiségű bLT-t 32-35%-os acetonitrillel/eluáltuk (0,1% trifluorecetsavban). 4. példa bLT elleni monoklón antitest előállítása A hibridoma előállításánál Kohler, G. módszerét követtük (Kohler, G. et al., Nature, 1975,256,495-497) az alábbi eltérésekkel: i) Két BALB/c egeret oltottunk be intraperitoneálisan és szubkután több helyen kb. 750 ng/egér mennyiségű bLT-t tartalmazó Freud-féle komplett adjuvánssal. A bLT-t a 2. példa szerint állítottuk elő, majd anti-szarvasmarha-szérum immunaffinitásos oszlopra adagoltuk. ii) Egy hónap elteltével mindegyik egeret a fenti módon 125 ng bLT-vei (Freud-féle hordozóban) ismételten beoltottuk. A bLT-t az i) pontban leírtak szerint állítottuk elő, majd még Sepharose 12 márkanevű agaróz mátrixon gélszűrtük. iii) További három hét elteltével mindegyik egeret Ismételten beoltottuk szubkután és intravénásán 1,75 pg/bLT-vel (Alhydrogel-ben: 2%-os vizes alumínium-hidroxid). A bLT-t a 3. példa szerinti Sepharose CM oszlopról nyertük, majd még gélszűréssel tisztítottuk. iv) Az utolsó emlékeztető oltásnál egy hónappal később 5,75 pg bLT/egér mennyiséget intravénásán alkalmaztunk. A bLT-t a iii) pont szerint nyertük és tisztítottuk. Három nappal később az egereket leöltük és a lépsejteket alkalmaztuk a P3-NSI/IAgr-I myeloma sejtekkel való fúzióhoz (J. Mól. Bioi, 1974, 90, 691). A kapott hibridomákat ezután ismert módon klónoztuk és tenyésztettük. A klónozott hibridomákat immunoradiometriával vagy immunodot folt vizsgálattal mutattuk ki együttesen egy olyan vizsgálattal, amelyjelezte az aktivitás kiválását immunoprecipitálásnál. így választottuk ki a kívánt antitest kiválasztására alkalmas kiónokat 5. példa bLT fizikai-kémiai tulajdonságai A) Molekulatömeg A bLT látszólagos molekulatömegét gélszűréssel határoztuk meg. A 3. példa szerinti, a CM-Sepharose oszlopról lejövő bLT 200 pg-os mennyiségét 5X betöményítettük Amicon kevert sejt + YM10 membrán (Amicon Ltd.) segítségével. A betöményített mintát ezután Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia Ltd.) töltetű oszlopon gélszűrtük, az eluálást pH = 7,2-nél 0,5 ml/perc sebességgel adagolt foszfát pufferral végezve. Az eluátum citotoxikus aktivitásának meghatározását LM sejtek és semleges vörös festék alkalmazásával az 1. példában leírtak szerint végeztük. A kapott eredményeket 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
