202593. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új citotoxinok és ilyeneket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
9 HU 202 593 B 10 a 2. ábrán mutatjuk be, amelyen a szaggatott vonal felel meg a citotoxikus aktivitásnak és a számozott jelölések az ismert molekulatömegű fehérjék eluálási helyének felelnek meg. Ismert fehérjeként a következőket alkalmaztuk: 1. Apoferritin 2. ß-amiläz 3. Szarvasmarha szérum albumin 4. Karbon-anhidráz 5. Cytochrome C A 2. ábra alapján megállapítva a bLT molekulatömege 47 ± 5 kDa. B) Izoelektromos pont Az 1. példa szerint nyert, és az anti-limfoblasztoid interferon immunoaffinitásos oszlopról lejövő eluátumban lévő bLT nem kötődik a PBE 94 (Pharmacia Ltd.) kromatqfókuszáló oszlophoz a megadott körülmények között. így a kromatográfiás viselkedés alapján megállapítható, hogy a bLT látszólagos izoelektromos pontja 7,7-nel nagyobb. C) Aminosav analízis A 3. példa szerinti Pro RPC oszlopról lejövő bLT-t 6n sósavban hidrolizáljuk, majd ismert módon a Waters „Pico-Tag” rendszer alkalmazásával meghatároztuk az aminosav-tartalmat. Az aminosav összetétel számításnál 47 kDa molekulatömeget vettünk alapul. 6. példa bLT biológiai tulajdonságai A) bLT, TNFa és TNFß citotoxikus aktivitása A vizsgálandó emlős scjtvonalak mindegyiket azonos módon vizsgáltuk a citotoxikus aktivitással szembeni érzékenység meghatározására. A vizsgálatot a következőképpen végeztük. A sejtvonalakat 5-10% borjúmagzat szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközegben tenyésztettünk. Az exponenciális növekedési fázis végén a tápközeget 1% borjúmagzat szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközeggel cseréltük le. 200 pl-es mintát vettünk, amely 104 mennyiségű sejtet tartalmazott és ezt 0,3 ml-es lyukakkal ellátott mikrotitráló tálcába helyeztük (Costar). Párhuzamos log2 hígítási sorokat készítettünk a bLT- ból (amelyet a 3. példa szerinti Mono Q oszlopról vettünk le és koncentrációja 3250 U volt LM sejtekkel meghatározva) 1% borjúmagzat szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközeg alkalmazásával. A hígításokat 50 p/lyuk mennyiségben a vizsgálandó sejtekhez adagoltuk két párhuzamos sorban, amely azonos hígításokat tartalmazott. A vizsgálandó sejteket ezután nedves, 37 °C hőmérsékletű inkubátorba helyeztük és 5% széndioxidban 48 órán át inkubáltuk. A folyamat végén a fenti tápközeg 40 pl-es mennyiségével 4 pCi (metil-3H)-timidint (Amcrsham International, England; 52 Ci/mM) vittünk be minden lyukba. A vizsgálandó sejtek jelzését a fenti inkubátorban 18 órán át végeztük. A tápközeget ezután ellávolítottuk a hozzálapadó sejtektől (LM, L 929, RPMI 2650) és 200 |il 0,05%-os etilén-diamin-letraecetsavval helyettesítettük és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezután a sejteket mostuk, sejtbegyűjtővel (M-48R, Brandcl USA) üvegszálas szűrőtárcsára (Whatman 6F/B) gyűjtöttük. A mosáshoz foszfát puffert (pH = 7,2) alkalmaztunk. Minden szűrőtárcsát üvegfiolába helyeztünk, amelyek 5 ml szcintillációs folyadékot („Cocktail W”, British Drug Houses, Poole, Dorset, Anglia) tartalmaztak és folyadék szcintillációs számlálóval számoltuk. A vizsgált sejtek 50%-os elpusztításához szükséges bLT-egységeket az LM sejtek- 5 kel összehasonlítva probit analízissel (J. Gen. Virol, 1972,14,49) határoztuk meg. Az alkalmazott sejteket és a kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze. 10 Vizsgált sejtek bLT LM egységeinek száma, amely 50%-os pusztulást okoz LM lU/ml RPMI 2650 20 U/ml 15 L929 20 U/ml MOLT-4 25 U/ml K652 800 U/ml RAJI >1000 U/ml DAUDI >1000 U/ml 20 HL60 >1000 U/ml Sejtvonal ATCC Természete száma 25 LM CCL 1,2 Egér tumorogén fibroblaszt RPMI 2650 CCL 30 Humán orrsövény; kvázi-diploid tumor L929 CCL 1 Egér tumorogén fibroblaszt MOLT-4 CRL 1582 Humán perifériális vér; 30 K562 CCL 243 akut limfoblasztémiás leukémia Humán krónikus miclogeniás leukémia RAJI CCI86 Humán Burkitt-féle 35 DAUDI CCL 213 limfoma Humán Burkitt-féle limfoma HL 60 CC1 240 Humán perifériális vér promieloktikus leukémia 40 Humán colon adenocarcinoma sejtvonal HT 29 (ATCC No. HTB 38) felhasználásával trícium felszabadítási vizsgálattal határoztuk meg a bLT, a természetes TNFa és TNFß citotoxikus aktivitását. A bLT-t az 1. példa 45 szerinti anti-limfoblasztoid interferon immunoaffinitásos oszlopról nyertük. A természetes TNFa-t J 774.1 sejtekkel (Nature, 1975,257,393-394) stimulált lipopoliszaccharid felül úszójának formájában alkalmaztuk. A természetes TNFß-t szintén felülúszó formában alkal- 50 máztuk, amelyet a következők szerint állítottunk elő: RPMI 1788 sejteket (ATCC No. CCL 156) RPMI 1640 szérummentes tápközegre ráoltottunk (6 x 106 sejt/ml) 2 ng forbol-riirisztát-acetát jelenlétében és a sejteket 3 órán át 37 °C hőmérsékleten 5% szén-dioxid- 55 ban inkubáltuk, majd Phytohaemaglutint adtunk hozzá 5 pg/ml végső koncentrációban és az inkubálást még 48 órán át folytattuk. A sejteket ezután centrifugálással elválasztottuk, a felülúszó TNFß aktivitását L929 sejteken ellenőriztük, majd Amicon szűrő sejteken YM 10 60 membránnal (Amicon Ltd.) betöményítettük. A trícium felszabadítás vizsgálatot a következőképpen végeztük: A vizsgálandó sejteket jelzetté tettük úgy, hogy Dulbccco-féle módosítású Eagle-tápközegben, amelyet 65 25 mmól HEPES-sel, 5% termikusán inaktivált borjú6
