202593. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új citotoxinok és ilyeneket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
5 HU 202 593 B 6 ban vagy más kemoterápiás szerekkel kombináltan adagoljuk, ilyenek például az interferonok, tumor nekrózis faktorok, interleukinck és kolónia stimuláló faktorok. A bLT-t az állatoknak elsősorban intravaszkuláris, intratumorális, intrapcritoneális és intrapleurális módon adagoljuk. A bLT hatásos mennyisége állatok esetében természetesen számos körülménytől függ, így például az állatok korától, a betegség pontos mibenlététől és annak komolyságától, az adagolás módjától és végső soron a kezelőorvos megítélésére van bízva. Általában azonban 0. 02-10 pg/kg, előnyösen 0,1-4 pg/kg mennyiségben alkalmazzuk. Egy felnőtt humán egyed esetében a (kb. 70 kg) hatásos mennyiség például 1,4-700, előnyösen 7-280 pg. A következő példákkal a találmány szerinti eljárást mutatjuk be a korlátozás szándéka nélkül. A különböző oszlopokhoz kötött fehérjék mennyiségét 280 nm-en mutatott adszorpcióval határoztuk meg (A^). 1. példa bLT-ben dús oldat előállítása Nemalwa/WRL humán limfoblasztoid sejtvonalakat (ATTC CRL 1432) tenyésztettünk és indukáltunk (Fintor N. B. és mtársai, Cold Spring Harbour Symposia on Quantitative Biology, 1986, LI kötet, 571-575). A kapott sejt-felülúszót Sepharose-t (Pharmacia Ltd.) és anti-limfobiasztoid interferon poliklón antitestet (Finter N. B. , Fantes K. H. és Johnston M. D., Developments in Biological Standardisation, 1978, 38, 343-348; Fantes K. H., Burmán C. J., Ball G. D., Johnston M. D. és Finter N. B„ Biochemical Characterisation of Lymphokines, 1980,343-351, szerkesztő: A. L. dc Wcck,F. Kristensen and M. Lardy, New York and London, Academic Press) tartalmazó oszlopon átengedjük, majd szintén az előzőekben leírtak szerint járunk el (Secher D. S. és Burke D. C. , 1980, Nature, 1980,285,446-450). Ez a lépés lényegében az összes limfoblasztoid interferont eltávolítja. Az oszlopról lejövő bLT-tartalmú folyadékot (500 ml), O, 025 mólos imidazol-HCl-lel pH = 7,7-nél dializáltuk és 1 cm x 30 cm-es PBE 94 (Pharmacia Ltd.) töltetű, előzőleg a fenti pufferral kiegyensúlyozott oszlopra adagoltuk. 11 ml/óra sebességgel végzett folyamatos adagolást végeztünk és 11 ml-es frakciókat vettünk le. Az oszlopot ezután 100 ml fenti pufferral mostuk, az 500 ml 8-szorosra hígított Polybuffer 74-gyel (Pharmacia Ltd.) pH = 4-nél végzett cluálás előtt. Az eluálás alatt a frakciók mennyiségét 3 ml-re változtattuk. Az anyag legalább 80%-a megkötődött az oszlopon (Aao) és így a bLT-től elválasztható. Az oszlopra megkötött anyag fehérje koncentrációja kb. 2 mg/ml és citotoxikus aktivitása 56 U/ml, az oszlopról lejövő bLT- tartalmú folyadék koncentrációja kb. 0,33 mg/ml és citotoxikus aktivitása 40 U/ml. A kiindulási anyagban is jelenlévő, az oszlophoz megkötött citotoxikus anyagot az oszlopról pH = 5,3- 6,3 közötti pH értéknél (csúcs pH = 5,7) eluáltuk. A citotoxikus aktivitás kimutatására LM sejteket (ATCC No. CCL 1,2) és semleges vörös festéket alkalmazunk és a kimutatást a következőképpen végezzük: az LM sejteket mikrotitráló lyukakban 5 x 104 sejt/ml (200 pl/lyuk) mennyiségben, 1% borjú-magzat szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközegre ráoltottuk. A vizsgálatokhoz szükséges hígításokat RPMI 1640 tápközeggel készítettük, amely 1% borjú-magzat szérumot tartalmazott. Minden hígításból 50 |il-es mintát helyeztünk a kettős lyukakba rögtön azután, hogy a sejteket beadagoltuk, és a mikrotitráló lemezeket 37 “C hőmérsékleten 5% szén-dioxidban inkubáltuk. 64-72 óra elteltével a sejteket 1,5 órán át 0,036% semleges vöröst, 0,9% NaCl-ot és 0,015 n HCl-t tartalmazó oldattal (50 pl/lyuk) megfestettük. A festőoldatot ezután a sejtekről leszívattuk és a sejteket 0,9%-os NaCl-oldattal mostuk. A sejteket ezután 200 pl/lyuk mennyiségben 50 tf%-os 0,9% NaCl/etanol eleggyel 30 percig szobahőmérsékleten mostuk, majd mértük az abszorpciót 540 nm-en. 2. példa bLT-ben dús oldat előállítása más módon Az 1. példában leírt anti-limfoblasztoid interferon poliklón antitest immunoaffinitásos oszlopról lejövő 40 liter folyadékot betöményítettük és egyidejűleg 0,01 mólos imidazol-HCl-lel szemben pH = 7,7-nél dializáltuk, Ashai mesterséges vese alkalmazásával (AM300; Kimai Scientific Products Ltd., Uxbridge, Middlesex, Anglia). A végső térfogat körülbelül 2,5 liter. A fenti betöményílett anyag 2 literét, 2,5 cm x 18 cm-es CM-Sepharose (Pharmacia Ltd.) oszlopra adagoltuk, amelyet előzőleg pH = 7,7-nél 0,01 mólos imidazol- HCl-lel kiegyensúlyoztunk. Az átengedési sebesség 50 ml/óra volt és három nagyobb frakciót vettünk le. Az oszlopot a 250 ml fenti púderral mostuk és 10 x 25 ml-es frakciót vettünk le. Az oszlopot ezután lineárisan növekvő ionerősségű oldattal eluáltuk, amelyet 1 liter fenti imidazol-HCl-pufferből és 1 liter ilyen púderrel készült 1 mólos nátrium-klorid oldatból állítottunk elő. Az eluálás alatt 10 ml-es frakciókat vettünk le. Az oszlopról lejövő anyag és az eluens oldat fehérje tartalma olyan volt, hogy az A^o módon meghatározott értékek a méréshatáron kívül estek és így az oszlopon megkötött anyag mennyiségét becsülni sem lehetett. Az eluációs profilon belül eső különböző frakciók citotoxikus aktivitását megvizsgáltuk LM sejtek és semleges vörös festék alkalmazásával az 1. példában leírtak szerint. Aktivitás két területen mutatkozott, 0,08-0,11 mól NaCl-nál és 0,28-0,33 mól NaCl-nál. Ez két különböző formájú bLT-t reprezentálhat. 3. példa bLT-tartalmú tisztított oldat készítése Namalwa/WRL vonalból származó humán limfoblasztoid sejteket RPMI 1640 tápközegben tenyésztettünk, amelyet 7 d% felnőtt szarvasmarha szérummal, 0,5 t/tf% triptonnal és 3 mg/ml mennyiségű glükózzal egészítettünk ki. Amikor a sejtsűrűség a 2,5-3 x 106 sejt/ml értéket elérte, a tenyészetet 7% fenti szérummal kiegészített RPMI 1640 tápközeggel 1,0-1,5 x 106 sejt/ml értékre hígítottuk, majd hozzáadtunk annyi 1 mólos nátrium-bulirátot, hogy a végső koncentráció 2 mmól legyen. A tenyészetet ezután 37 'C hőmérsékleten 2 napon át kevertük, majd 10 percig 800 ford/perc mellett centrifugáltuk (Mistral centrifuga, 6 literes, M. S. E., Manor Royal, Crawley, W. Sussex, Anglia). A kiülepedett sejteket mostuk és szérummentes RPMI 1640- ben szuszpcndálluk, amely még a következő anyagokat tartalmazta: 1 mmól glutamin, 0,5 t/tf% tripton, 3,5 mg/ml glükóz, 1 mg61iter inzulin, 0,14 mg/liter putreszcin, 2 mg/liter lecitin és 2,2 mg/ml nátrium-hidrogén-karbonát. Ezután Sendai vírust tartalmazó (1 tf%) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
