202593. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új citotoxinok és ilyeneket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 HU 202 593 B 4 0,14 mg/ml putreszcin 2 mg/ml lecitin, és 2,2 mg/ml nátrium-hidrogén-karbonát. Indukálószerként előnyösen például vírusokat, különösen Sendai vírust alkalmazunk, fokozószenei, így például karbonsavval vagy karbonsav-sóval együtt. Az adagolt vírus végkoncentrációja előnyösen 5- 200 HAU/ml, különösen 20-50 HAU/ml (haemagglutináció egységül). Erőteljes keverés után a sejttenyészetet 12-48 órán át 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk az indukálási folyamat teljes végbemenetele érdekében. Amennyiben fokozószert is alkalmazunk, azzal a sejteket általában addig kezeljük, amíg a kívánt 0,5-10 x 106 sejt/ml koncentrációt eléljük. Legalábbis laboratóriumi méretekben, kívánatos lehet az alkalmazott fokozószer felesleget az indukálás előtt eltávolítani oly módon, hogy a sejteket kinyerjük, majd a sejteket ismételten a fentiek szerint szuszpendáljuk. Ha szabad karbonsavat alkalmazunk, a tápközegben utólagosan a normál esetben benne levő különböző szervetlen és szerves sókkal, annak sója képződik. Kívánt esetben a karbonsav-sót is, így például nátrium-, kálium- vagy ammónium-sót is alkalmazhatunk. A sejtvonalak indukálását, különösen fokozószerrel együttesen végzett inkubálásnál előnyösen például a 4 216 203 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módon végezzük. Az inkubálást és indukálást követően a bLT a tápközegben interferonnal és más egyéb termékkel együtt van jelen. A bLT izolálását a tápközegből előnyösen antilimfoblasztoid interferon antitest immunoaífinitásos oszloppal (a limfoblasztoid interferon eltávolítására) és kromatográfiás oszloppal (az esetlegesen jelenlévő savas izoelektromos pontú citotoxinok eltávolítására) végezzük. Ily módon lényegében tömény bLT-t nyerünk, amely limfoblasztoid interferontól és savas citotoxinoktól mentes. A limfoblasztoid interferon eltávolítására szolgáló immunoaffinitásos oszlop térhálósított agaróz gélt (SepharoseR, Pharmacia Ltd., Pharmacia House, Midsummer Boulevard, Central Milton Keynes, Bucks, Anglia, MK9 3HP) tartalmaz, amelyhez monoklón vagy poliklón anti-limfoblasztoid interferon antitest van kötve. A tápközeget centrifugáljuk vagy szűrjük a sejtek eltávolítására, majd a kapott tiszta fázist adjuk fel az oszlopra. Az oszlopról lejövő bLT-t tartalmazó folyadékot betöményíthetjük és ultracentrífugálhatjuk. A savas citotoxinok eltávolítását az immunoaffinitásos oszlopról lejövő és adott esetben betöményített folyadék kromatofókuszálásával vagy ioncserés kromatográfiájával végezzük. Mindkét esetben kihasználjuk azt az előnyt, hogy a bLT izoelektromos pontja legalább 7,7 és az esetlegesen jelenlévő savas citotoxinok izoelektromos pontja ennél jóval alacsonyabb. Ez lehetővé teszi az elválasztást az eluens sókoncentrációjának növelésével vagy pH-jának csökkentésével, az ioncserélő típusától függőén. A kromatofókuszálás esetében az oszlop térhálósított agaróz gélt tartalmaz, amelynek tercier- és kvatemer-amin funkciós csoportjai vannak. Ilyen töltet például a Pharmacia Ltd. által gyártott PBE 94 márkanevű termék. Az ioncserélő kromatográfiánál alkalmazott térhálósított agaróz gél funkciós csoportja általában dietil-amino-etil-csoport (anioncserélő) vagy karboxi-metil-csoport (kationcserélő). Ilyen töltetek például a Pharmacia Ltd. DEAE-Speharose CL-6B és CM-Sepharose CL-6B márkanevű termékei. A bLT és a savas citotoxinok tökéletes elválasztása érdekében előnyösen két ioncserélő oszlopot alkalmazunk. Az egyik, amely dietil-amino-etil funkciós csoportokat tartalmazó térhálósított agaróz gél-töltetű, megköti a savas citotoxinokat és átengedi a bLT-t a második oszlopra, amelynek karboxi-metil-funkciós csoportokat tartalmazó térhálósított agaróz töltete a bLT-t köti meg, de átengedi a savas citotoxinokat A bLT-ben gazdag oldatot ezután további tisztításnak vethetjük alá, hogy a legalább 90%-os, különösen legalább 95%-os tisztaságot elérjük. Ezt ismert módon például egy további kromatografáló oszloppal végezzük. Ha a limfoblasztoid sejtek inkubálására alkalmazott tápközeg szérumot tartalmaz, szükséges lehet a bLT-ben gazdag oldatot egy poliklon an ti szérumot tartalmazó immunoaffinitásos oszlopon átengedni a szennyező szérum-fehérjék eltávolítására. Más oszlopokban töltetként alkalmazhatunk például térhálósított agaróz gélt (Procion Red, HE-3B) és kvatemer amin funkciós csoportot tartalmazó monodiszperz hidrofil polimert. Ilyenek például a Pharmacia Ltd. Red. Sepharose CL-6B és Mono-Q márkanevű termékei. A találmány szerinti eljárással nyert bLT vagy immunogén determinánsa ismert módon immunogénként alkalmazható antitestek képzésére. Poliklón antitesteket nyerhetünk például laboratóriumi állatok bLT-val vagy immunogén determinánsával végzett immunizálásával, és az antiszérum kinyerésével. Monoklón antitesteket nyerhetünk egerek bLT-vel vagy immunogén determinánsával végzett immunizálásával, majd a szenzibilált lép-sejtek izolálásával és az ilyen sejtek myeloma sejtekkel végzett fúziójával, amikor is hibridoma sejteket nyerünk és ezeket a megfelelő módon klónozzuk és tenyésztjük. A bLT-vel nyert poliklón és monoklón antitesteket alkalmazzuk a bLT tisztítására affinitásos kromatográfiával, valamint felhasználjuk a bLT azonosítására és jellemzésére is. Mint azt már korábban is említettük, a bLT-nek daganatellenes hatása van és ily módon alkalmazható daganatos betegségek kezelésére és gyógyítására. Erre a célra a bLT-t megfelelő formába kell hozni, azaz a bLT-t megfelelő gyógyszerészeti hordozóanyaggal kell elkeverni. Ezen gyógyszerkészítmények előállítási eljárása szintén a találmány oltalmi körébe tartozik. A találmány szerinti eljárással nyert gyógyszerkészítmények előnyösen adagolásra alkalmas injekciós vagy infúziós készítmények. Ezek adott esetben semleges pH értékre beállított oldatok, amelyek az izotonicitáshoz szükséges mennyiségben sóoldatot vagy dextrózt tartalmaznak, de tartalmazhatnak még különböző stabilizátorokat is, így például humán szérum albumint vagy inert cukrot A bLT-t előnyösen liofilizált formában szereljük ki, amely megfelelő módon vízzel felhasználásra előkészíthető közvetlen az adagolás előtt. A gyógyszerkészítményeket, akár nedves, akár liofilizált formában előnyösen zárt, steril műanyag vagy üvegedényekben szereljük ki. A daganatos betegségek kezelésére a bLT-t hatásos mennyiségben adagoljuk az állatoknak, és a nyert bLT a humán- és állatgyógyászati készítményekhez is felhasználható. A találmány szerinti eljárással nyert bLT-t önmagá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
