202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
7 HU 202 587 B 8 restrikciós hely van, a kívánt EcoRI-Taql fragmenst legjobban úgy állíthatjuk elő és sokszorosíthatjuk, ha az előzőleg ligáit pHI7A4Al EcoRI-Hpal és Hpal-Taql fragmenseket a pBR322 plazmid EcoRI-Clal restrikciós helyébe klónozzuk. Az így kapott 4,6 kb nagyságú plazmidot pNM608 jellel jelöljük, ez tartalmazza a trp transzkripciós aktivációs szekvenciát, és így felhasználható a találmány szerinti eljárás további kiviteli példáiban. A fentiekben ismertetett trp aktivációs szekvenciát tartalmazó, szemléltető jelleggel megadott plazmidok előállítására például ligáljuk: 1) a 0,29 kb nagyságú EcoRI-Taql, a pNM608 plazmidból származó fragmenst; 5 2) a pCZIOl plazmid 10 kb nagyságú EcoRI-BamHI fragmensét; 3) a pCZIOl 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmensét, és 4) az alábbiakban megadott bármelyik dezoxi-ribo- 10 nukleotid-szekvenciát: 1. 5’CGACA ATG TTC CCA III III III III 3’ TGT TAC AAG GGT GCC ATG TCC TTG TCC GGC 5 I I I I I I I I I I I I I I I I I I CGG TAC AGG AAC AGG CCG 2. 5’CGACA ATG TTC CCA 10 I I I I I I I I I I I I 3’ TGT TAC AAG GGT ATG TTC TTG TCC GGC III III III III III TAC AGG AAC AGG CCG 5’ CGACC ATG GAT CAG III III III III 3’ TGG TAC CTA GTC 20 TTG TCC GGC CTC ITT GCC III III III III III III AAC AGG CCG GAG AAA CGG 25 4. 5’CGACC ATG GAT GAT III III III III 3’ TGG TAC CTA CTA TCC GGC CTC TTT GCC III III III III III AGG CCG GAG AAA CGG 5’ CGACC ATG GAT GAT III III III III 3’ TGG TAC CTA CTA 35 TCC TTG TCC GGC CTC TTT III ill III III III III AGG AAC AGG CCG GAG AAA 40 TTG I I I AAC 30 • 5. 15 GCC I I I CGG 3. TTG 1 1 1 GAG 1 1 1 GAT 1 1 1 GAT 1 1 1 TAA 1 1 i ATG f 1 1 TTC i i i CCA 1 1 1 1 1 1 AAC i 1 1 CTC 1 1 1 CTA 1 1 1 CTA 1 1 1 ATT 1 1 1 TAC 1 i 1 AAG 1 1 1 GGT CTC 1 1 1 TTT 1 1 I GCC 1 1 t AAC 1 1 1 GCT 1 1 1 GTGCT 1 3’ 1 1 1 GAG 1 1 i AAA 1 1 1 CGG 1 1 1 TTG 1 1 1 CGA C 5’ TTG GAT GAT GAT TTA ATG TTC CCA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 AAC CTA CTA CTA ATT TAC AAG GGT CTC 1 1 1 TTT 1 1 1 GCC 1 I 1 AAC t 1 1 GCT 1 ! 1 GTGCT 1 3’ 1 1 1 GAG 1 1 1 AAA 1 1 1 CGG 1 1 1 TTG 1 I 1 CGA 1 C 5’ GAG TAA ATG TTC CCG GCT ATG TCC 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 CTC ATT TAC AAG GGC CGA TAC AGG AAC 1 1 1 GCT 1 1 1 GTGCT 1 3’ 1 1 I TTG 1 1 1 CGA 1 C 5’ AAG i i i TAA 1 1 1 ATG 1 1 I TTT i i i CCG 1 1 1 GCT 1 1 1 ATG i i i TCC 1 ! 1 i i i TTC 1 1 1 ATT 1 1 i TAC i i i AAA 1 1 1 GGC 1 1 1 CGA i i i TAC 1 I I AGG AAC i i i GCT t 1 1 GTGCT 1 3’ i i i TTG 1 1 1 CGA 1 C 5’ AAG i i i GAG Í 1 1 TAA 1 1 1 ATG 1 I 1 TTT 1 1 1 CCG 1 1 1 GCT i i i ATC 1 1 1 i i i TTC 1 1 1 CTC 1 1 1 ATT 1 1 1 TAC 1 1 1 AAA 1 1 1 GGC i 1 i CGA 1 1 1 TAC GCC i i i AAC 1 1 1 GCT 1 1 1 GTGCT i 3’ 1 1 i CGG 1 1 1 TTG 1 1 I CGA c 5’ A fentiek szerint végzett ligációk után sorrendben az alábbi, 10,8 kb nagyságú plazmidokat kapjuk meg: pCZ105.1, pCZl05.2, pCZ106.1, pCZ112.1 és pCZ 112.2. Ezek a plazmidok transzkripciót követően olyan egyszerű policisztronos hírvivő ribonukleinsavat határoznak meg, amelyek kódolják az előpeptidet és a metionin-szarvasmarha növekedési hormont, így tovább szemléltetik a találmány szerinti eljárást. A szemléltető jelleggel bemutatott pCZ105.1 plazmid restrikciós térképét a mellékelt 9. ábrán adjuk meg. A találmány szerinti eljárás igen rugalmas, azaz gya-55 korlatilag bármely funkcionális polipeptidet meghatározó nukleotid-szekvenciát behelyettesíthetünk a fentiekben példaként megadott metionin-szarvasmarha növekedési hormont kódoló szekvenciával. Ilyen kódoló szekvenciák például - nem limitálóan - a humán növe- 60 kedési hormont, a humán pre-növekedési hormont, a sertés növekedési hormont, emlős növekedési hormont, madár növekedési hormont, növekedési hormont felszabadító faktort, humán inzulin A láncot, humán inzulin B láncot, humán proinzulint, humán pre-proinzulint, hu- 65 mán és nem-humán interferont, urokinázt, szöveti plaz-5
