202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
9 HU 202 587 B 10 minogén aktivátort, interleukin Il-t, továbbá bármely polipeptid hormont, bármely polipeptid enzimet és bármely kutatási vagy gyakorlati értékű, biológiailag aktív polipeptidet meghatározó szekvenciát. Részletesebben szólva, a humán növekedési hormont kifejező, szemléltető jelleggel ismertetett vektor előállítására a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmensét és a pNM575 jelű plazmid dezoxi-ribonukleinsav 0,5 kb nagyságú BamHI-FnuDII fragmensét ligáljuk az alábbi linker szekvenciához: 5’-CTAG AGGGTATTAATA ATG TTC CCA TTG GAG GAT GAT TAA ATG 3’---------------TCCCATAATTAT TAC AAG GGT AAC CTC CT A CTA ATT TAC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG AAG GGT TGG TAA GGG AAT AGG TCC GAA AAA CTG TTG CGA TAC CTC CG-3’ GAG GC-5\ ahol A dezoxi-adenil-csoport, G dezoxi-guanil-csoport, C dezoxi-citozil-csoport és T timidilcsoport. A kapott, pCZl 140 jelű plazmid szekvenciálisán tartalmazza az 1. E. coli lipoprotein gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját, leolvasási fázisban egy olyan nukleotid-szekvenciával, amely leírja mind a riboszóma kötőhelyet, mind pedig az alábbi szekvenciájú proteint: MET PHE PRO LEU GLU ASP ASP, ahol MET metionin, PHE fenil-alanin, PRO prolin, LEU leucin, GLU glutaminsav és ASP aszparaginsav; 2. megfelelően elhelyezett és a fenti pepiidet meghatározó szekvenciával leolvasási fázisban levő transzlációs stop jelet; 3. a fenti stop szignállal közvetlenül szomszédos és 3’-irányba eső transzlációs start jelet, amely leolvasási fázisban van a metionil-humán növekedési hormont leíró nukleotid szekvenciával; és 4. megfelelően elhelyezett és a metionil-humán növekedési hormont leíró szekvenciával leolvasási fázisban levő transzlációs stop jelet. A fentiekben leírt linker-szckvenciát ismert módon szintetizáljuk, az előzőekben megadott irodalmi hivatkozások szerint [Itakura és munkatársai (1977); Crea és munkatársai (1978)]. A pNM575 kiindulási plazmidot az 1-4. ábrán és az 1. példában megadottak szerint állítjuk elő. A pCZl 140 szemléltető jelleggel bemutatott plazmid restrikciós térképét a mellékelt 10. ábrán adjuk meg. A leírásban specifikus kiviteli változatként ismertetjük azt a plazmidot, amelynek replikációját egy hőindukálható, elveszthető (runaway) replikon határozza meg, ezt az 1 557 774 számú brit szabadalmi leírásban és az alábbi közleményből ismerhetjük meg: Uhlin és munkatársai, Gene, 6, 91 (1979). 30 °C hőmérséklet alatt, elsősorban 25 ”C-on a replikon viszonylag alacsony példányszámot, sejtenként 10-15 példányt határoz meg. Ha a hőmérsékletet 37 ‘C-ra növeljük, a példányszámot szabályozó rendszer elveszik, és a replikont tartalmazó plazmid dezoxi-ribonuklcinsav száma sejtenként eléri az 1000-2000 darabot. Egy adott elveszthető replikont tartalmaz a leírásban ismertetett pIM-I’-A3 dezoxi-ribonukleinsav. Érthetően, a találmány nem limitálható egy adott elveszthető replikonra vagy példányszám mutánsra. Más, indukálható elveszthető replikonokat vagy magas példányszámot biztosító replikonokat kaphatunk megfelelő szelekcióval vagy állíthatunk elő az alábbi közleményben megadott módon: Nemzetközi W082/02901 számú szabadalmi leírás és Bittner és Vapnck, Gene, 15, 319 (1981). Használhatunk ezen kívül nem elveszthető replikonokat, mindaddig, míg ezek funkcionálnak E. coli, Bacillus, Streptomyces vagy más, megfelelő mikroorganizmus scjLbcn. Replikonként például - nem limitáló jelleggel - használhatunk például bármely, alábbiakban felsorolt replikont: pMBl, ColEl, NR1, RK2, RK6, pSCIOl, RP1, RP4, F és másokat, közöttük olyan bakteriofágokat, amelyek E. coli sejtekben rcplikálódnak. Használhatunk pEL7, pEL103, SCP2, SCP2* plazmidokból származó replikonokat, használhatunk Streptomyccs sejtekben replikálódó bakteriofágokat és pC194, pBSl, pE194, pUBllO, pT127 és más hasonló, köztük Bacillus sejtekben replikálódó bakteriofágokat is. A témában jártas szakember felismeri, hogy ezek és más elveszthető replikonok használhatók a találmány szerinti eljárásban felhasznált expressziós vektorok konstruálására. A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák és plazmidok számtalan más módosítása és variációja előállítható. így például a genetikai kód degeneráltsága miatt bármely aminosavat meghatározó nukleotid helyettesíthető, de helyettesíthető például a TAG vagy TG A transzlációs stopjel a TAA »9» »»» > J » ATC ACT ATT transzlációs stop jellel. Ezenkívül a transzkripciós aktivációs szekvencia és a második transzlációs start kodon között a vektorban több nukleotid változtatható, mindaddig módosíthatunk, míg megfelelő transzlációs szignálok (riboszóma kötőhely és első transzlációs start jel) és stop szignálok maradnak jelen. További változtatások lehetségesek, például: 1. az első transzlációs stop jel leolvasási fázisának áthelyezését a második transzlációs start jelhez képest úgy, hogy egy vagy több nuklcotidot építünk be; 2. egy vagy több nukleotid triplctcl helyezünk be úgy, hogy a leolvasási fázis megmarad az első transzlációs stop szignál és a második transzlációs start szignál között; 3. az első cisztron (a transzkripciós aktivációs szekvenciát is magába foglaló szakasz és az első transzlációs stop jel közötti régió) hosszát változtatjuk úgy, hogy nukleotid triplcteket helyezünk be az első transzlációs start- és stop szignálok közé. Bár a cisztron hossza nem kritikus, előnyös az, amely 2- 20 aminosavat kódol. Az első cisztront leíró nukleotid triplcteket megválaszthatjuk ismert elképzelések és megalapozott vélemények alapján [Zukcr és Slicglcr, Nucleic Acids Rese-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
